ICS 67.050 X 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 22986—2008 牛奶和奶粉中氢化泼尼松残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of prednisolone residues in milk and milk powder- LC-MS-MS method 2008-12-31发布 2009-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T22986—2008 前言 本标准的附录A、附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国内蒙古出人境检验检 疫局、内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司。 本标准主要起草人：潘国卿、白国涛、张春艳、刘来俊、郑书展、李红、张伟、李梅、常建军、庞国芳 GB/T22986—2008 牛奶和奶粉中氢化泼尼松残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准适用于牛奶和奶粉中氢化泼尼松残留量的测定。 本标准方法检出限：牛奶为0.5ug/kg，奶粉为4.0μg/kg 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义（GB/T6379.1- 2004,ISO5725-1:1994.IDT GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004，ISO5725-2：1994，IDT） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987，MOD） 3方法原理 试样中的氢化泼尼松用甲醇-乙酸缓冲溶液提取，正已烷除脂，固相萃取柱净化，液相色谱-串联质 谱仪测定，外标法定量，选择离子定性。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1甲醇：色谱纯。 4.2甲酸：色谱纯。 4.3正已烷：色谱纯。 4.4冰乙酸。 4.5三水乙酸钠。 4.60.2mol/L乙酸溶液：吸取5.72mL冰乙酸（4.4）至500mL容量瓶中，用水定容至刻度 4.70.2mol/L乙酸钠溶液：称取27.22g三水乙酸钠（4.5），用水溶解后转移至1000mL容量瓶中， 水定容至刻度。 4.8乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH=5.2）：量取21mL乙酸溶液（4.6）与79mL乙酸钠溶液（4.7）混合， 调节溶液的pH=5.2。 4.930%甲醇水溶液：量取30mL甲醇（4.1），用水稀释定容至100mL。 4.10甲醇饱和正已烷：量取甲醇（4.1)10mL置于分液漏斗中，加正已烷（4.3）90mL，振荡混合 1min，静置分层后，取上层液备用。 4.11氢化泼尼松标准品：纯度大于99%。 4.12氢化泼尼松标准储备溶液：准确称取氢化泼尼松标准品，用甲醇（4.1）配成0.10mg/mL的标准 1 GB/T22986—2008 储备溶液，于一18℃避光储存。 4.13氢化泼尼松标准工作溶液：根据需要吸取适量的氢化泼尼松标准储备溶液（4.12），用甲醇（4.1） 逐级稀释成适当浓度的标准工作溶液，于一18℃避光储存 4.14氢化泼尼松基质标准工作溶液：根据需要吸取适量的氢化泼尼松标准工作溶液（4.13），用阴性样 品提取液稀释配制成浓度范围为0.50ng/mL~100ng/mL的系列基质标准工作溶液，该溶液应现用现 配。 4.15固相萃取柱：OasisHLB柱或性能相当者,500mg、6mL。使用前用5mL甲醇（4.1)和5mL水 进行活化 4.16滤膜0.2um。 5仪器和设备 5.1液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。 5.2 分析天平：感量0.01mg和0.01g。 5. 3 固相萃取真空装置。 5.4均质器。 5.5旋转蒸发器。 5. 6 离心机。 5.7 微量注射器：50μL。 5.8 氮气吹干仪。 5. 9 旋涡混合器。 6 6试样的制备与保存 6.1试样的制备 6.1.1牛奶：取有代表性试样约500g，搅拌均匀后装入洁净容器内密封并做好标识。 6.1.2奶粉：取有代表性试样约500g，搅拌均匀后装人洁净容器内密封并做好标识。准确称取12g 乳粉试样（精确到0.01g）于250mL烧杯中，少量多次加人50mL煮沸并冷却到60℃左右的水溶解， 冷却至室温后，移入100mL容量瓶中，用少量水分次淋洗烧杯，淋洗液一并移入容量瓶，再用水定容到 刻度，混匀，制备成奶粉复原乳试样。 6.2试样的保存 将试样于4℃保存 7测定步骤 7.1提取 准确称取5g牛奶试样（精确到0.01g）或量取5.00mL奶粉复原乳试样（6.1.2）于50mL离心管 中，依次加入10mL乙酸缓冲溶液（4.8）、15mL甲醇（4.1)和10mL甲醇饱和正已烷（4.10），用均质器 以15000r/min提取1min，并用约2mL甲醇（4.1)淋洗均质器，用离心机在4℃以10000r/min离心 10min，弃去上层正已烷层，清液转人鸡心瓶中，在40℃下旋转蒸发至体积小于10mL，待净化 7.25净化 将上述浓缩液以小于等于3mL/min的速度通过预先活化好的固相萃取柱（4.15），依次用5ml 水、3mL30%的甲醇水溶液（4.9）和5mL正已烷（4.3）淋洗固相萃取柱，弃去全部淋洗液。减压抽干 1min，然后用6mL甲醇（4.1)洗脱。洗脱液在低于40℃氮气吹干至体积小于2mL,用甲醇（4.1)定容 至2.00mL，混匀后，过0.2μm有机相滤膜（4.16），供液相色谱-串联质谱仪测定。 2 GB/T22986—2008 7.3阴性样品提取液的制备 取不含氢化泼尼松的阴性牛奶或者奶粉样品按7.1和7.2步骤制备阴性样品提取液，用于配制氢 化泼尼松基质标准工作溶液。 7.4测定条件 7.4.1液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下： 色谱柱：AcquityUPLCTMBEHCi,1.7μm，100mmX2.1mm(内径)或相当者； a) b) 柱温：35℃； 进样量：5μL； c) d) 流动相及流速见表1。 表1 液相色谱梯度洗脱条件 时间/min 流速/（mL/min） 水（含0.1%的甲酸）/% 甲醇/% 80 0.00 90 10 3.00 0.3 10 90 5.00 0.3 10 90 6.00 0.3 90 10 8.00 0.3 90 10 7.4. 2 质谱参考条件 质谱参考条件如下： 离子源：电喷雾离子源（ESI）； a) b) 扫描方式：负离子扫描； c) 检测方式：多反应监测（MRM）； d) 锥孔电压：23V； e) 毛细管电压：3.00kV； f) 离子源温度：110℃； g) 脱溶剂气温度：400℃； h) 脱溶剂气流：400L/h； i) 锥孔气流量：50L/h； j) 碰撞气压力：0.36Pa； k) 碰撞气：氩气； 1) 氢化泼尼松定性离子对、定量离子对、碰撞能量及驻留时间见表2。 表2氢化泼尼松定量离子对、定性离子对、碰撞能量及驻留时间 定量离子对(m/) 定性离子对(m/） 碰撞能量/eV 驻留时间/s 405.4/329.5 23 0.05 405.4/329.5 405.4/359.6 15 0. 05 7.4.3液相色谱-串联质谱测定 7.4.3.1定性测定 在相同的实验条件下进行样品测定时，如果样品中待测物质的色谱峰保留时间与标准品色谱峰保 AcquityUPLCTMBEHCIs是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是 1) 表示对该产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 3