ICS 67.050 X 04 GR 中华人民共和国国家标准 GB/T 22991—2008 牛奶和奶粉中维吉尼霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of virginiamycin residue in bovine milk and milk powder- LC-MS-MS method 2008-12-31发布 2009-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T22991—2008 前言 本标准的附录A、附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局，中华人民共和国辽宁出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：宋文斌、李一尘、董振霖、隋凯、赵景红、薛大芳、张华一、李振荣、庞国芳。 GB/T22991—2008 牛奶和奶粉中维吉尼霉素残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了原料乳和纯奶粉中维吉尼霉素M1（virginiamycinM1）残留量测定的液相色谱-串联 质谱测定方法。 本标准适用于原料乳和纯奶粉中维吉尼霉素M1残留量的测定 本标准的方法检出限：原料乳中维吉尼霉素MI为0.25uμg/L,纯奶粉中维吉尼霉素Ml为2.0uμg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注明日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义（GB/T6379.1 2004,ISO5725-1:1994,IDT) 性与再现性的基本方法（GB/T6379.22004，ISO5725-2：1994，IDT） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987，MOD） 3原理 试样中残留的维吉尼霉素M1在甲醇十乙睛混合提取液中涡旋提取、离心、取上清液用磷酸二氢铵 缓冲溶液稀释，于CIs固相萃取柱进行净化。将洗脱液中的维吉尼霉素M1用三氯甲烷分离萃取，去除 水层。氮吹三氯甲烷至干，用甲酸铵缓冲溶液与甲醇混合液溶解并定容，供液相色谱-串联质谱仪测定。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1乙酸。 4.2甲酸：色谱纯。 4.3甲醇：色谱纯。 4.4乙 乙睛：色谱纯。 4.5三氯甲烷：色谱纯。 4.6 磷酸二氢铵：优级纯。 4.7甲酸铵：优级纯。 4.8磷酸二氢铵溶液：0.1mol/L，称取11.50g磷酸二氢铵（4.6），用水溶解定容至1000mL。 4.9磷酸二氢铵溶液：0.01mol/L，量取0.1mol/L磷酸二氢铵溶液（4.8)100mL，用水稀释定容至 1 000 mL 4.10甲酸铵缓冲液：0.12mol/L，pH=3.2,称取7.56g甲酸铵（4.7），用水溶解，用甲酸（4.2）调节 pH到3.2,定容至1000mL。 4.11甲酸铵缓冲液：0.003mol/L，pH=3.2，量取25.0mL的甲酸铵缓冲液（4.10）,用水稀释定容至 1 GB/T22991—2008 1 000 mL。 4.12 2甲醇+乙腈溶液（1+1）。 4.13水+乙腈溶液（4十1）。 4.14水十甲醇溶液（13十7）。 4.15 5水+甲醇溶液（9+11）。 4.16流动相A:0.003mol/L甲酸铵缓冲液（4.11)用0.2μm滤膜过滤。 流动相B：甲醇+乙睛溶液（1+1)（4.12）用0.2μm滤膜过滤 4.17标准物质：维吉尼霉素M1（CAS:21411-53-0），纯度95%。 4.18标准储备溶液：0.1mg/mL。准确称取适量的维吉尼霉素M1标准物质，用甲醇配成0.1mg/ml 的标准储备溶液。该溶液在4℃保存。 注：称取标准物的质量是按纯度修正过的质量 4.19标准工作溶液：根据维吉尼霉素M1的灵敏度和仪器线性范围，用空白样品提取液配成不同浓度 的标准工作溶液。标准工作溶液在4℃保存。 5仪器 5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源。 5. 2 离心机：最大转速为10000r/min。 5. 3 离心管：锥形底玻璃离心管40mL、15mL和10mL，具塞；锥形底聚内烯离心管50mL具螺旋盖 5. 4 电子天平：感量0.1mg和0.1g。 5.5 过滤器：聚四氟乙烯膜过滤器：0.22um×13mm尼龙膜过滤器：0.22um×47mm。 5.6 移液器：量程为1mL~10mL和5mL~50mL。 5.7 5.8 流动相过滤装置。 5. 9 氮气浓缩仪。 5.10 高速涡流混合器。 5. 11 振荡器。 5.12 酸度计：精确度为土0.02。 5.13 超声波仪。 5.14 一次性注射器：1mL。 5.15 固相萃取柱：BondElutCi8，500mg，柱长为6mL。 5.16 鸡心瓶：150mL。 5.17 贮液器：100mL。 5.18 试样瓶：2mL。 5.19 一次性移液管。 5.20 滤纸。 6试样的制备与保存 6.1试样的制备 将原料乳和纯奶粉样品分别混合均匀。各自分出0.5kg作为试样，将分出的试样密封，并作上 标记。 6.2试样保存 将试样置于4℃条件下贮存。 2 GB/T 22991—2008 7测定步骤 7.1提取 7.1.1原料乳样品 称取原料乳5.00mL，精确到0.01mL，放入50mL聚丙烯离心管中，加人10ml的甲醇十乙睛溶 液（1十1）涡旋1min，高速振荡10min，离心15min（5000r/min），将上清液转移至40mL离心管中。 再向残渣中加人2mL甲醇十乙腈溶液（1十1）涡旋5s，高速振荡5min，在5000r/min下离心10min。 合并两次上清液与40mL离心管中。加人15mL的0.01mol/L磷酸二氢铵溶液（4.9），高速振荡 5min，以5000r/min离心10min，用滤纸过滤至150mL的鸡心瓶中，加人80mL磷酸二氢铵缓冲液 （4.9)混匀待净化。 7.1.2纯奶粉样品 称取纯奶粉0.625g，精确到0.001g，放人50mL聚丙烯离心管中加水4.375g，超声溶解得到复 原乳。加人10mL的甲醇十乙睛溶液（1十1）涡旋1min，以下步骤同原料乳样品。 7.2净化 依次用5mL乙睛、5mL水和5mL的磷酸二氢铵（4.9）洗涤活化固相萃取柱（5.15）。在柱上装上 贮液器（5.17），将样液（7.1)过柱，移去贮液器（5.17）。依次用2mL水，10mL水十乙睛溶液（4十1）， 2mL水和10mL水十甲醇溶液（13十7）洗柱，弃去全部流出液。最后用5mL水十甲醇溶液（9+十11)洗 涤维吉尼霉素M1，收集洗脱液到15mL的玻璃离心管中。将10mL三氯甲烷（4.5）加人洗脱液中，振 荡5min，离心10min（5000r/min）。用一次性移液管定量收集三氯甲烷层到10ml离心管中，在 （4.11），高速涡旋5s。样液用0.2um的滤膜过滤到样品瓶中，供液相色谱-串联质谱仪测定 7.3色谱测定 7.3.1液相色谱条件 液相色谱条件如下： 色谱柱：SunFireCis，5μm，150mmX2.1mm（内径）或相当者； b) 柱温：40℃； 进样量：30μL； c) d) 色谱柱总流量：300μL/min； e) 流动相及梯度见表1。 表1 流动相及梯度 时间/min 流动相A/% 流动相B/% 0.00 93 7 20.00 40 60 26.00 40 60 28.00 93 7 35.00 93 7 7.3.2质谱条件 质谱条件如下： a) 离子源：电喷雾离子源； b) 扫描方式：正离子扫描； c) 检测方式：多反应检测； d) 电喷雾电压（IS)：5000V； e) 雾化气压力（CAS1)：517.1kPa; 3