ICS 67.050 X 04 GR 中华人民共和国国家标准 GB/T 22985—2008 牛奶和奶粉中恩诺沙星、达氟沙星、 环丙沙星、沙拉沙星、奥比沙星、 二氟沙星和麻保沙星残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination of enrofloxacin,danofloxacin,ciprofloxacin,sarafloxacin orbifloxacin,difloxacin and marbofloxacin in milk and milk powder- LC-MS-MS method 2009-05-01实施 2008-12-31发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T22985—2008 前言 本标准的附录A、附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国河北出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：陈瑞春、吕红英、段文仲、郭春海、艾连峰、邢军、马育松、姚春毅、庞国芳。 1 GB/T22985—2008 牛奶和奶粉中恩诺沙星、达氟沙星、 环丙沙星、沙拉沙星、奥比沙星 二氟沙星和麻保沙星残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了牛奶和奶粉中恩诺沙星、达氟沙星、环丙沙星、沙拉沙星、奥比沙星、二氟沙星和麻保 沙星残留量液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于牛奶和奶粉中恩诺沙星、达氟沙星、环丙沙星、沙拉沙星、奥比沙星、二氟沙星和麻保 沙星残留量的测定和确证。 沙星均为1ug/kg；奶粉中恩诺沙星、达氟沙星、环丙沙星、沙拉沙星、奥比沙星、二氟沙星和麻保沙星均 为 4 μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义 (GB/T6379.1—2004,ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004，ISO5725-2：1994，IDT） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987,MOD） 3原理 用乙腈和磷酸盐缓冲溶液提取试样中残留的恩诺沙星、达氟沙星、环丙沙星、沙拉沙星、奥比沙星、 外标法定量。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为优级纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1甲醇：色谱纯。 4.2乙腈：色谱纯。 4.3磷酸：色谱纯。 4.4甲酸：色谱纯。 OasisHLB固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表 1） 1 GB/T22985—2008 4.5磷酸氢二钠，NazHPO·12HzO。 4.6磷酸二氢钾,KH,PO。 4.7氨水。 4.8磷酸盐缓冲溶液（0.05mol/L）：称取5.68g磷酸氢二钠（4.5）和1.36g磷酸二氢钾（4.6），放人 1000mL烧杯中，加人800mL水溶解，用磷酸（4.3）调至pH=3.0，再用水定容至1000mL。 4.95%氨水甲醇溶液：吸取50mL氨水（4.7）与950mL甲醇（4.1)混合。 4.10甲酸溶液（pH=3.0）：量取500mL水，用甲酸（4.4)调pH值到3.0。 4.1125%甲醇溶液：量取250mL甲醇（4.1)用水稀释到1.000mL。 4.12甲醇-甲酸溶液（15十85）：量取30mL甲醇（4.1)与170mL甲酸溶液（4.10）混合。 4.13标准物质：恩诺沙星、达氟沙星、环丙沙星、沙拉沙星、奥比沙星、二氟沙星、麻保沙星标准物质，纯 度大于等于95%。 4.14标准储备溶液：0.1mg/mL。准确称取适量的每种标准物质，用甲醇（4.1）配成0.1mg/mL的 标准储备溶液，该溶液在4℃保存。 4.15混合标准中间溶液：1g/mL。分别吸取1mL标准储备溶液（4.14）放入100mL容量瓶中，用 甲醇（4.1)定容至刻度。该溶液在4℃保存。 4.16混合标准工作溶液：根据需要用空白样品提取液配不同浓度的混合标准工作溶液，混合标准工 作溶液在4℃保存。 4.17OasisHLB固相萃取柱或相当者：60mg，3mL。使用前分别用5mL甲醇和5mL水和5mL磷 酸盐缓冲溶液（4.8）活化，保持柱体湿润。 4.18滤膜0.2μm。 5仪器和设备 5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源。 5.2 分析天平：感量0.1mg和0.01g。 5.3 涡旋振荡器。 5. 4 固相萃取装置。 5.5 氮气吹干仪。 5.6 真空泵：最大负压80kPa。 5.7 pH计：测量精度土0.02pH单位。 5.8贮液器：通过转接头连接于OasisHLB固相萃取柱上。 5.9离心机。 5.10旋转蒸发仪。 5.11具刻度离心管：10mL。 6试样的制备与保存 6.1试样的制备 将牛奶从冰箱中取出，放置至室温，摇匀，备用。 6.2试样保存 牛奶置于4℃冰箱中避光保存，奶粉常温避光保存。 7测定步骤 7.1提取 7.1.1牛奶 称取2g试样，精确到0.01g，置于50mL具塞塑料离心管中，加人10mL乙睛，于涡旋振荡器振 2 GB/T22985—2008 荡提取1min，5000r/min离心5min，上清液过滤到鸡心瓶中，在残渣中加入5mL磷酸盐缓冲溶液 （4.8），10mL乙腈，重复以上步骤，合并上清液，于50℃旋转蒸发，至乙腈全部蒸出。加人5mL磷酸 盐缓冲溶液，混匀。 7.1.2奶粉 称取0.5g试样，精确到0.01g，置于50mL具塞塑料离心管中，加入6mL磷酸盐缓冲溶液 （4.8），涡旋混匀，再加人10mL乙，于涡旋振荡器振荡提取1min，5000r/min离心5min，上清液过 滤到鸡心瓶中，在残渣中加人5mL磷酸盐缓冲溶液，10mL乙腈，重复以上步骤，合并上清液，于50℃ 旋转蒸发，至乙全部蒸出。加人5mL磷酸盐缓冲溶液，混匀。 7.2净化 将7.1的样液转移到贮液器中，再用5mL磷酸盐缓冲溶液洗鸡心瓶，洗液合并到贮液器，以约 1mL/min的流速全部过HLB固相萃取小柱（4.17），待样液完全流出后，先后以4mL水、4mL25%甲 醇水溶液淋洗，抽干，用4mL5%氨水甲醇溶液（4.9）洗脱于10mL具刻度离心管中，洗脱液于50℃， 氮气吹至约0.2mL时停止浓缩，用甲醇-甲酸溶液（4.12）定容至1mL，5000r/min离心5min，过 0.2um滤膜，供液相色谱串联质谱分析 7.3空白基质溶液的制备 将取牛奶阴性样品2g，奶粉阴性样品0.5g，按7.1和7.2操作。 7.4测定条件 7.4.1液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下： 色谱柱：Cis，5μm，150mm×2.1mm（内径）或相当者； b) 色谱柱温度：30C； c) 进样量：15μL； 流动相梯度及流速见表1。 表1# 液相色谱梯度洗脱条件 时间/min 0.1%乙酸水溶液/% 甲醇/% 流速/（μL/min） 0.00 200 80 20 5.00 200 40 60 9.00 200 40 60 9.10 200 80 20 11, 00 200 80 20 7. 4. 2 质谱参考条件 质谱参考条件如下： a) 离子化模式：电喷雾正离子模式（ESI十）； b) 质谱扫描方式：多反应监测（MRM）； c) 鞘气压力：104kPa； d) 辅助气压力：138kPa； e) 正离子模式电喷雾电压（IS)：4000V； f) 毛细管温度：320℃； g) 源内诱导解离电压：10V； h) Q1,Q3分辨率：Q1为0.4，Q3为0.7； i) 碰撞气：高纯氩气； j) 碰撞气压力：0.2Pa； 3