ICS 67.050 X 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 22987—2008 牛奶和奶粉中呋喃它酮、呋喃西林、 喃妥因和喃唑酮代谢物 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 Determination for the residues of furaltadon,nitrofurazone nitrofurantoin and furazolidone metabolites in milk and milk powder- LC-MS-MS method 2009-05-01实施 2008-12-31发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T22987—2008 前言 本标准的附录A、附录B和附录C为资料性附录。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局 本标准主要起草人：张进杰、曹亚平、刘晓茂、曹彦忠、王静淑、杨志伟、庞国芳 GB/T22987—2008 牛奶和奶粉中呋喃它酮、呋喃西林、 喃妥因和呋喃唑酮代谢物 残留量的测定 液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了牛奶和奶粉中呋喃它酮代谢物（5-吗啉甲基-3-氨基-2-嗯唑烷基酮，英文缩写为 AMOZ）、呋喃西林代谢物（氨基脲，英文缩写为SEM）、呋喃妥因代谢物（1-氨基-2-内酰脲，英文缩写为 AHD)和呋喃唑酮代谢物（3-氨基-2-唑烷基酮，英文缩写为AOZ)残留量液相色谱-串联质谱测定 方法。 本标准适用于牛奶和奶粉中AMOZ、SEM、AHD和AOZ残留量的测定。 本标准的方法检出限：牛奶中AMOZ、SEM、AHD和AOZ的检出限均为0.2uμg/kg；奶粉中 AMOZ、SEM、AHD和AOZ的检出限均为1.6μg/kg。 注：本标准中呋喃它酮、喃西林、呋喃妥因和呋喃唑酮及代谢物中英名称及英文缩写参见附录A中的表A.1。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义 (GB/T6379.12004.ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004,ISO5725-2：1994,IDT） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987，MOD） 3原理 牛奶或奶粉试样用三氯乙酸水解并脱蛋白，硝基喃类代谢物在酸性条件下用2-硝基苯甲醛衍生 标法定量。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为优级纯。 4.1水:GB/T6682,一级 4.2甲醇：色谱纯。 4.3乙睛：色谱纯。 4.4乙酸乙酯：色谱纯。 4.5磷酸氢二钾,K,HPO。 4.6 乙酸。 4.7 二甲亚砜。 1 GB/T22987—2008 4.8盐酸。 4. 9 三氯乙酸，C,HCl02。 4.10氢氧化钠。 4.112-硝基苯甲醛（2-NP）,C,H,NO：含量≥99% 4.120.1mol/L磷酸氢二钾溶液：称取17.4g磷酸氢二钾（4.5），用水溶解，定容至1000mL。 4.130.2mol/L盐酸：量取17mL浓盐酸（4.8），用水定容至1000mL 4.144mol/L氢氧化钠溶液：称取80g氢氧化钠（4.10），用水溶解，定容至500mL。 4.150.5mol/L三氯乙酸溶液：称取37.5g三氯乙酸（4.9），用水溶解，定容至500mL。 4.16衍生剂：含2-硝基苯甲醛0.05mol/L。称取0.075g2-硝基苯甲醛（4.11)溶于10mL二甲亚砜 （4.7），现用现配。 4.17样品定容溶液：取10mL乙腈（4.3），0.3mL乙酸（4.6），用水稀释到100mL。 4.18标准物质：AMOZ（CAS:43056-63-9）、SEM（CAS:563-41-7）、AHD（CAS:2827-56-7)和AOZ (CAS:80-65-9),纯度均≥99%。 4.19同位素标记物标准物质：Ds-AMOZ、13C15N-SEM、13C:-AHD和D.-AOZ。四种内标标准物质的 纯度均≥99%。 4.201.0mg/mL标准储备溶液：分别称取适量的四种硝基呋喃代谢物标准物质（4.18），分别用甲醇 稀释成1.0mg/mL的标准储备溶液。避光保存于一18℃冰柜中。 稀释成0.1ug/mL的混合标准溶液，避光保存于一18℃冰柜中。 4.221.0mg/mL同位素标记物混合内标储备溶液：分别称取适量的四种硝基呋喃代谢物的同位素标 记物标准物质（4.19），分别用甲醇配成1.0mg/mL的标准储备液。避光保存于一18℃冰柜中。 4.230.1μg/mL同位素标记物混合内标溶液：分别移取适量的四种硝基呋喃代谢物的同位素标记物 内标储备溶液（4.22），用甲醇稀释成0.1μg/mL的混合内标标准溶液，避光保存于一18℃冰柜中。 4.24OasisHLB固相萃取柱或相当者：60mg，3mL。使用前依次用5mL甲醇和10mL水预处理， 保持柱体湿润。 4.25滤膜：0.2μm。 5仪器 5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源。 5.2分析天平：感量0.1mg和0.01g。 5.3液体混匀器。 5.4 固相萃取装置。 5.5 氮气吹干仪。 5.6恒温振荡水浴。 5.7 真空泵：真空度应达到80kPa。 5.8 微量注射器：25μL，100μL。 5.9棕色具塞离心管：25mL，50mL。 5.10 0pH计：测量精度士0.02pH单位。 5.11贮液器：50mL。 OasisHLB固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表 1） 示对该产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2 GB/T22987—2008 5.12高速离心机：转速10000r/min以上。 6试样的制备与保存 6.1试样的制备 实验室样品混合均匀，分出0.5kg作为试样。 6.2试样保存 试样置于一18℃冰柜，避光保存。 7测定步骤 7.1待测样品溶液的制备 7.1.1牛奶样品脱蛋白、水解和衍生化 称取牛奶样品8g（精确到0.01g），置于50mL棕色离心管中，加人15mL三氯乙酸溶液（4.15）。 向上述离心管中加入0.2mL衍生剂（4.16），再加人适量混合内标溶液（4.23）.使四种硝基呋喃代谢物 内标物最终定容浓度均为2.0ng/ml。用液体混匀器混匀，置于37℃恒温振荡水浴中避光反应16h。 离心管取出后放置至室温，在10000r/min下离心10min，上清液倒人另一棕色离心管中。 7.1.2奶粉样品脱蛋白、水解和衍生化 15mL三氯乙酸溶液（4.15）。向上述离心管中加人0.2mL衍生剂（4.16），再加人适量混合内标溶液 （4.23），使四种硝基呋喃代谢物内标物最终定容浓度均为2.0ng/mL。用液体混匀器混匀，置于37℃ 入另一棕色离心管中。 7.1.3样品溶液净化 上述衍生溶液加入5mL0.1mol/L磷酸氢二钾溶液（4.12），用4mol/L氢氧化钠溶液（4.14）调节 溶液pH约为7.4，在10000r/min下离心10min，上清液倒入下接OasisHLB固相萃取柱（4.24)的贮 液器中，在固相萃取装置上使样液以小于2mL/min的流速通过OasisHLB固相萃取柱（4.24），待样液 全部通过固相萃取柱后用20mL20%甲醇水淋洗固相萃取柱，弃去全部流出液。抽干OasisHLB固相 萃取柱（4.24)15min。用5mL乙酸乙酯（4.4)洗脱，收集洗脱液于25mL棕色离心管中，在氮气吹干 仪上45℃水浴吹干，准确加人1.0mL样品定容溶液（4.17）溶解残渣，混匀后过0.2μm滤膜（4.25）， 供液相色谱-串联质谱测定。 7.2混合基质标准校准溶液的制备 7.2.1牛奶混合基质标准校准溶液的制备 称取五个阴性牛奶样品，每个样品为8g（精确到0.01g）。分别加人适量混合标准溶液（4.21），制 成四种硝基呋喃代谢物含量均为0.1μg/kg、0.2μg/kg、0.5μg/kg、1.0μg/kg和2.0μg/kg的基质标 准溶液，再分别加入适量混合内标溶液（4.23），含量均为2.0ng/mL。同7.1.1和7.1.3操作，作为牛 奶标准校准曲线。 7.2.2奶粉混合基质标准校准溶液的制备 称取五个阴性奶粉样品，每个样品为1g（精确到0.01g）。分别加人适量混合标准溶液（4.21），制 成四种硝基呋喃代谢物含量均为0.8μg/kg、1.6μg/kg、4.0μg/kg、8.0μg/kg和16.0μg/kg的基质 标准溶液，再分别加人适量混合内标溶液（4.23），含量均为2.0ng/mL。同7.1.2和7.1.3操作，作为 奶粉标准校准曲线。 7.3测定条件 7.3.1液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下： 3