ICS 67.050 X 04 中华人民共和国国家标准 GB/T22988—2008 牛奶和奶粉中螺旋霉素、吡利霉素、 竹桃霉素、替米卡星、红霉素、泰乐菌素 残留量的测定液相色谱-串联质谱法 Determination of spiramycin,pirlimycin,oleandomycin,tilmicosin, erythromycin and tylosin residues in milk and milk powder- LC-MS-MS method 2008-12-31发布 2009-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T22988—2008 前言 本标准的附录A、附录B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国河北出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：郭春海、艾连峰、段文仲、陈瑞春、马育松、窦彩云、刘宝圣、张增利、庞国芳。 GB/T22988—2008 牛奶和奶粉中螺旋霉素、吡利霉素 竹桃霉素、替米卡星、红霉素、泰乐菌素 残留量的测定液相色谱-串联质谱法 1范围 本标准规定了牛奶和奶粉中螺旋霉素、吡利霉素、竹桃霉素、替米卡星、红霉素、泰乐菌素残留量的 高效液相色谱-串联质谱测定方法。 本标准适用于牛奶和奶粉中螺旋霉素、吡利霉素、竹桃霉素、替米卡星、红霉素、泰乐菌素残留量的 测定和确证。 本标准的方法检出限：牛奶为1μg/kg，奶粉为8μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 (GB/T 6379.1—2004,ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2一2004，ISO5725-2：1994，IDT） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987，MOD） 3原理 用乙睛提取试样中的分析物，固相萃取柱净化，高效液相色谱-串联质谱测定，外标法定量。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1乙腈，液相色谱纯。 4.2甲醇，液相色谱纯。 4.3乙酸，液相色谱纯。 4.4甲酸铵，液相色谱纯 4.5磷酸氢二钠。 4.6氢氧化钠。 4.7甲醇-水溶液（3+7）:300mL甲醇与700mL水混合。 4.85mol/L氢氧化钠溶液：称取20g氢氧化钠，用水溶解，定容至100mL。 4.90.1mol/L磷酸盐缓冲溶液：6g磷酸氢二钠（4.5)溶解于450mL水中，用氢氧化钠（4.8）溶液调 节pH=8，加水至500mL，使用前配制。 4.100.1mol/L甲酸铵溶液：0.63g甲酸铵（4.4)加水溶解至1000mL。 4.11标准品：螺旋霉素（spiramycin，CAS：8025-81-8）、吡利霉素（pirlimycin，CAS：79548-73-5）、竹桃 霉素（oleandomycin，CAS：7060-74-4）、替米卡星（tilmicosin，CAS：108050-54-0）、红霉素（erythromycin， 1 GB/T22988—2008 CAS：114-07-8）、泰乐菌素（tylosin，CAS：1401-69-0），纯度均大于等于98% 4.12标准储备液：分别精确称取适量标准品，用甲醇配制成100μg/mL的标准储备液 4.13混合标准中间工作液：取标准储备液（4.12)各1mL至100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，配 制成混合标准工作液，浓度为1μg/mL。 4.14滤膜：0.45μm。 4.15HLB固相萃取柱l或相当者：500mg，6mL。使用前依次用3mL甲醇、3mL水和3mL磷酸盐 缓冲溶液（4.9)预处理。 5仪器和设备 5.1 高效液相色谱-串联质谱仪：配有电喷雾离子源（ESI）。 5.2离心机：转速大于3000r/min。 5.3 旋涡混合器。 5.4旋转蒸发仪。 5.5氮吹仪。 5.6固相萃取装置。 6试样的制备与保存 6.1牛奶 取均勾样品约250g装人洁净容器作为试样，密封置4℃下保存，并标明标记。 6.2奶粉 取均匀样品约250g装人洁净容器作为试样，密封，并标明标记 7测定步骤 7.1提取 7.1.1牛奶 称取4g.准确至0.01g，牛奶样品于50mL具塞离心管中，加入20mL乙睛振荡提取2min后， 3000r/min离心10min，移取上清液过滤至鸡心瓶中。再用10mL乙睛重复提取一次，合并上清液于 同一鸡心瓶中。 7.1.2奶粉 称取0.5g，准确至0.01g，奶粉样品，加入4mL水于50mL具塞离心管中，混匀。加人20mL乙 睛振荡提取2min后，3000r/min离心10min，移取上清液过滤至鸡心瓶中。再用10mL乙睛重复提 取一次，合并上清液于同一鸡心瓶中。 7.2净化 将提取液于45℃下旋转蒸发至约4mL左右，加入2mL磷酸盐缓冲液（4.9），混匀后，转移到已条 件化的HLB固相萃取柱（4.15）上，再用2mL磷酸盐缓冲液洗涤鸡心瓶两次，洗液一并转移到柱上，以 小于2mL/min流速滴下。接着依次用3mL水和2mL甲醇-水溶液（4.7）淋洗并抽干柱，最后用6mL 乙洗脱并收集于10mL带刻度的玻璃管中（此过程流速小于2mL/min）。洗脱液在45℃水浴上氮 气吹至约1mL，用甲酸胺溶液（4.10）定容至2mL，涡旋混合后，过0.45μm滤膜供HPLC-MS-MS 分析。 7.3空白基质溶液的制备 将取牛奶阴性样品4g，奶粉阴性样品0.5g，精确到0.01g，按7.1和7.2操作 1）HLB固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表示对该 产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2 GB/T22988—2008 7. 4 测定条件 7. 4. 1 液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下： a) 色谱柱：苯基柱，5μm，150mmX2.1mm（内径）或相当者； b) 色谱柱温度：30℃； c) 进样量：15μL； d) 流动相梯度及流速见表1。 表 1 液相色谱梯度洗脱条件 时间/min 流速/(μL/min) 0.1%甲酸水溶液/% 甲醇/% 0.00 200 80 20 6. 00 200 20 80 8. 00 200 20 80 8. 01 200 80 20 10. 0 200 80 20 7.4. 2 质谱参考条件 质谱参考条件如下： a) 离子化模式：电喷雾正离子模式（ESI十）； b) 质谱扫描方式：多反应监测（MRM）； c) 鞘气压力：104kPa； (P 辅助气压力：138kPa； e) 正离子模式电喷雾电压（IS)：4000V； f) 毛细管温度：350℃； g) 源内诱导解离电压：10V； h) Q1为0.7,Q3为0.7； i) 碰撞气：高纯氩气； j) 碰撞气压力：0.2Pa； k) 参考保留时间、监测离子对和裂解能量见表2。 表2参考保留时间、监测离子对和裂解能量 化合物名称 保留时间/min 监测离子对(m/≥) 裂解能量/eV 843.50/173.87 36 螺旋霉素 4.73 843.50/540.09 29 411. 12/111. 98 25 吡利霉素 4.78 411.12/363.02 14 688. 46/158.20a 35 竹桃霉素 5, 62 688.46/544.30 20 869.57/173.83 41 替米卡星 88s 869.57/155.89 37 734.18/157.88 红霉素 6. 12 734.18/576.13 20 916.36/173.80* 38 泰乐菌素 6.33 916.36/772.18 28 “为定量离子对，对于不同质谱仪器，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳 3