ICS 67.050 X 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 22990—2008 牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、 强力霉素残留量的测定 液相色谱-紫外检测法 Determination of oxytetracycline,tetracycline,chlortetracycline, doxycycline residues in milk and milk powder- HPLC-UV method 2008-12-31发布 2009-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T22990—2008 前言 本标准的附录A、附录 B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国河北出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人：郭春海、窦彩云、陈瑞春、马育松、艾连峰、吕红英、贾海涛、姚春毅、庞国芳。 SAC GB/T22990—2008 牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、 强力霉素残留量的测定 液相色谱-紫外检测法 1范围 本标准规定了牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量液相色谱-紫外检测测定 方法。 本标准适用于牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定 本标准的方法检出限：牛奶中土霉素、四环素为5μg/kg、金霉素、强力霉素为10μg/kg。奶粉中土 霉素、四环素为25μg/kg、金霉素、强力霉素为50μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第1部分：总则与定义（GB/T6379.1 2004,ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度（正确度与精密度）第2部分：确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法（GB/T6379.2—2004，ISO5725-2：1994,IDT） GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987MOD） 3原理 用0.1mol/LNa2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液提取试样中四环素族抗生素残留，OasisHLB或相当 的固相萃取柱和羧酸型阳离子交换柱净化，液相色谱仪测定，外标法定量。 4试剂和材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1甲醇：色谱纯。 4.2乙睛：色谱纯。 4.3磷酸氢二钠（NazHPO·12HzO)。 4.4柠檬酸(CH.O·H,O)。 4.5乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA·2H,O)。 4.6草酸(C,H,O4·2H20)。 4.70.2mol/L磷酸氢二钠溶液：称取71.63g磷酸氢二钠（4.3），用水溶解，定容至1000mL。 4.80.1mol/L柠檬酸溶液：称取21.04g柠檬酸（4.4）,用水溶解，定容至1000mL。 4.9Mcllvaine缓冲溶液：将625mL0.2mol/L磷酸氢二钠溶液（4.7)与1000mL0.1mol/L柠檬酸 溶液（4.8)混合，必要时用NaOH或HCl调pH=4.0士0.05。 4.100.1mol/LNa2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液：称取60.50g乙二胺四乙酸二钠（4.5）放入1625mL Mcllvaine缓冲溶液（4.9）中，使其溶解，摇匀。 1 GB/T22990—2008 4.110.01mol/L草酸溶液：称取1.26g草酸（4.6），用水溶解，定容至1000mL。 4.12甲醇-水（1+19）：量取5mL甲醇（4.1)与95mL水混匀。 4.14土霉素（oxytetracycline，CAS:2058-46-0），四环素（tetracycline，CAS：64-75-5）、金霉素（chlortet racyclineCAS：64-72-2）强力霉素（doxycycline，CAS：24390-14-5）标准物质：纯度大于等于96%。 4.150.1mg/mL土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准储备溶液：准确称取适量的土霉素、四环素、 金霉素、强力霉素标准物质（4.14），分别用甲醇配成0.1mg/mL的标准储备液。储备液于一20℃ 保存。 4.16土霉素、四环素、金霉素、强力霉素混合标准工作溶液：根据需要用流动相将土霉素、四环素、金霉 4.17OasisHLB固相萃取柱或相当者：500mg，6mL。使用前分别用5mL甲醇和10mL水预处 理，保持柱体湿润。 4.18羧酸型阳离子交换柱：500mg，6mL。使用前用5mL甲醇预处理，保持柱体湿润。 5仪器 SAG 5.1液相色谱仪：配有紫外检测器。 5.2分析天平：感量0.1mg,0.01g。 5.3涡旋振荡器。 5.4冷冻离心机：转速大于5000r/min。 5.5 固相萃取装置。 5.6真空泵。 5.7 氮气吹干仪。 5.8pH计：测量精度±0.02 5.9刻度样品管：10mL，精度为0.1mL。 6试样的制备与保存 6.1试样的制备 将牛奶从冰箱中取出，放置至室温，摇匀，备用。 6.2试样保存 牛奶置于0℃～4℃冰箱中避光保存，奶粉常温避光保存。 7测定步骤 7.1提取 牛奶试样称取10g（精确到0.01g），置于50mL具塞塑料离心管中。奶粉试样称取2g（精确到 0.01g），置于50mL具塞塑料离心管中。向试样中加人20mL0.1mol/LNazEDTA-Mcllvaine缓冲 溶液（4.10），于涡旋振荡器上混合2min，于10℃，5000r/min离心10min，上清液过滤至另一离心管 中。残渣中再加入20mL缓冲溶液，重复提取一次，合并上清液。 7.2净化 将上清液（7.1）通过处理好的OasisHLB柱（4.17），待上清液完全流出后，用5mL甲醇-水（4.12） 淋洗，弃去全部流出液。减压抽干5min，最后用5mL甲醇（4.1）洗脱，收集洗脱液于10mL样品管中。 1）OasisHLB固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称，给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不是表 示对该产品的认可。如果其他产品具有相同的效果，则可使用这些等效产品。 2 GB/T22990—2008 将收集的洗脱液通过羧酸型阳离子交换柱（4.18），待洗脱液全部流出后，用5mL甲醇（4.1）洗柱 减压抽干，用4mL0.01mol/L草酸-乙睛溶液（4.13）洗脱，收集洗脱液于10mL样品管中，45℃氮气 吹至1.5mL左右，流动相定容至2mL，供液相色谱-紫外检测器测定。 7.3测定条件 7.3.1液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下： a） 色谱柱：Kromasil100-5Cis，5μm，150mmX4.6mm（内径）或相当者； b) 流动相：0.01mo1/L草酸溶液-乙-甲醇（77+18+5）； 流速：1.0mL/min; d) 柱温：40℃； e) 检测波长：350nm； f) 进样量：60μl 7. 3. 2 液相色谱测定 将混合标准工作溶液（4.16）分别进样，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线，用标 准工作曲线对样品进行定量，样品溶液中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的响应值均应在仪器测定的 线性范围内。在上述色谱条件下，王霉素、四环素、金霉素、强力霉素的参考保留时间分别为3.09min、 3.73min、8.27min和12.53min。土霉素、四环素、金霉素，强力霉素标准物质液相色谱图参见附录A 中的图 A.1。 7.4平行试验 按以上步骤，对同一试样进行平行试验测定。 7.5空白试验 除不称取试样外，按以上步骤同时完成空白试验 7.6回收率试验 向阴性试样中添加标准溶液，均按上述步骤操作，测定后计算试样中添加的回收率。添加浓度及回 收率范围参见附录B中的表B.1。 8结果计算 被测物残留量的测定按式（1)计算： VV1000 X, = ci X ..(1) m^1000 式中： X，一试样中被测组分残留量，单位为微克每千克（μg/kg)； c一一从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度；单位为纳克每毫升（ng/mL）； V—样品溶液定容体积，单位为毫升（mL）； m一一样品溶液所代表试样的质量，单位为克（g）。 计算结果应扣除空白值。 9精密度 9.1一般规定 本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的，其重复性和再现性的 值是以95%的可信度来计算。 9.2重复性 在重复性条件下，获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r，牛奶和奶粉中土霉素、 3