ICS 67.050 X 04 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 22990—2008 牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、 强力霉素残留量的测定 液相色谱-紫外检测法 Determination of oxytetracycline,tetracycline,chlortetracycline, doxycycline residues in milk and milk powder- HPLC-UV method 2008-12-31发布 2009-05-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T22990—2008 前言 本标准的附录A、附录 B为资料性附录。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位:中华人民共和国秦皇岛出人境检验检疫局、中华人民共和国河北出人境检验检 疫局。 本标准主要起草人:郭春海、窦彩云、陈瑞春、马育松、艾连峰、吕红英、贾海涛、姚春毅、庞国芳。 SAC GB/T22990—2008 牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、 强力霉素残留量的测定 液相色谱-紫外检测法 1范围 本标准规定了牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量液相色谱-紫外检测测定 方法。 本标准适用于牛奶和奶粉中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素残留量的测定 本标准的方法检出限:牛奶中土霉素、四环素为5μg/kg、金霉素、强力霉素为10μg/kg。奶粉中土 霉素、四环素为25μg/kg、金霉素、强力霉素为50μg/kg。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件,其随后所有 的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件,其最新版本适用于本标准 GB/T6379.1测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第1部分:总则与定义(GB/T6379.1 2004,ISO5725-1:1994,IDT) GB/T6379.2测量方法与结果的准确度(正确度与精密度)第2部分:确定标准测量方法重复 性与再现性的基本方法(GB/T6379.2—2004,ISO5725-2:1994,IDT) GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法(GB/T6682—2008,ISO3696:1987MOD) 3原理 用0.1mol/LNa2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液提取试样中四环素族抗生素残留,OasisHLB或相当 的固相萃取柱和羧酸型阳离子交换柱净化,液相色谱仪测定,外标法定量。 4试剂和材料 除另有说明外,所用试剂均为分析纯,水为GB/T6682规定的一级水。 4.1甲醇:色谱纯。 4.2乙睛:色谱纯。 4.3磷酸氢二钠(NazHPO·12HzO)。 4.4柠檬酸(CH.O·H,O)。 4.5乙二胺四乙酸二钠(Na2EDTA·2H,O)。 4.6草酸(C,H,O4·2H20)。 4.70.2mol/L磷酸氢二钠溶液:称取71.63g磷酸氢二钠(4.3),用水溶解,定容至1000mL。 4.80.1mol/L柠檬酸溶液:称取21.04g柠檬酸(4.4),用水溶解,定容至1000mL。 4.9Mcllvaine缓冲溶液:将625mL0.2mol/L磷酸氢二钠溶液(4.7)与1000mL0.1mol/L柠檬酸 溶液(4.8)混合,必要时用NaOH或HCl调pH=4.0士0.05。 4.100.1mol/LNa2EDTA-Mcllvaine缓冲溶液:称取60.50g乙二胺四乙酸二钠(4.5)放入1625mL Mcllvaine缓冲溶液(4.9)中,使其溶解,摇匀。 1 GB/T22990—2008 4.110.01mol/L草酸溶液:称取1.26g草酸(4.6),用水溶解,定容至1000mL。 4.12甲醇-水(1+19):量取5mL甲醇(4.1)与95mL水混匀。 4.14土霉素(oxytetracycline,CAS:2058-46-0),四环素(tetracycline,CAS:64-75-5)、金霉素(chlortet racyclineCAS:64-72-2)强力霉素(doxycycline,CAS:24390-14-5)标准物质:纯度大于等于96%。 4.150.1mg/mL土霉素、四环素、金霉素、强力霉素标准储备溶液:准确称取适量的土霉素、四环素、 金霉素、强力霉素标准物质(4.14),分别用甲醇配成0.1mg/mL的标准储备液。储备液于一20℃ 保存。 4.16土霉素、四环素、金霉素、强力霉素混合标准工作溶液:根据需要用流动相将土霉素、四环素、金霉 4.17OasisHLB固相萃取柱或相当者:500mg,6mL。使用前分别用5mL甲醇和10mL水预处 理,保持柱体湿润。 4.18羧酸型阳离子交换柱:500mg,6mL。使用前用5mL甲醇预处理,保持柱体湿润。 5仪器 SAG 5.1液相色谱仪:配有紫外检测器。 5.2分析天平:感量0.1mg,0.01g。 5.3涡旋振荡器。 5.4冷冻离心机:转速大于5000r/min。 5.5 固相萃取装置。 5.6真空泵。 5.7 氮气吹干仪。 5.8pH计:测量精度±0.02 5.9刻度样品管:10mL,精度为0.1mL。 6试样的制备与保存 6.1试样的制备 将牛奶从冰箱中取出,放置至室温,摇匀,备用。 6.2试样保存 牛奶置于0℃~4℃冰箱中避光保存,奶粉常温避光保存。 7测定步骤 7.1提取 牛奶试样称取10g(精确到0.01g),置于50mL具塞塑料离心管中。奶粉试样称取2g(精确到 0.01g),置于50mL具塞塑料离心管中。向试样中加人20mL0.1mol/LNazEDTA-Mcllvaine缓冲 溶液(4.10),于涡旋振荡器上混合2min,于10℃,5000r/min离心10min,上清液过滤至另一离心管 中。残渣中再加入20mL缓冲溶液,重复提取一次,合并上清液。 7.2净化 将上清液(7.1)通过处理好的OasisHLB柱(4.17),待上清液完全流出后,用5mL甲醇-水(4.12) 淋洗,弃去全部流出液。减压抽干5min,最后用5mL甲醇(4.1)洗脱,收集洗脱液于10mL样品管中。 1)OasisHLB固相萃取柱是Waters公司产品的商品名称,给出这一信息是为了方便本标准的使用者,并不是表 示对该产品的认可。如果其他产品具有相同的效果,则可使用这些等效产品。 2 GB/T22990—2008 将收集的洗脱液通过羧酸型阳离子交换柱(4.18),待洗脱液全部流出后,用5mL甲醇(4.1)洗柱 减压抽干,用4mL0.01mol/L草酸-乙睛溶液(4.13)洗脱,收集洗脱液于10mL样品管中,45℃氮气 吹至1.5mL左右,流动相定容至2mL,供液相色谱-紫外检测器测定。 7.3测定条件 7.3.1液相色谱参考条件 液相色谱参考条件如下: a) 色谱柱:Kromasil100-5Cis,5μm,150mmX4.6mm(内径)或相当者; b) 流动相:0.01mo1/L草酸溶液-乙-甲醇(77+18+5); 流速:1.0mL/min; d) 柱温:40℃; e) 检测波长:350nm; f) 进样量:60μl 7. 3. 2 液相色谱测定 将混合标准工作溶液(4.16)分别进样,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准工作曲线,用标 准工作曲线对样品进行定量,样品溶液中土霉素、四环素、金霉素、强力霉素的响应值均应在仪器测定的 线性范围内。在上述色谱条件下,王霉素、四环素、金霉素、强力霉素的参考保留时间分别为3.09min、 3.73min、8.27min和12.53min。土霉素、四环素、金霉素,强力霉素标准物质液相色谱图参见附录A 中的图 A.1。 7.4平行试验 按以上步骤,对同一试样进行平行试验测定。 7.5空白试验 除不称取试样外,按以上步骤同时完成空白试验 7.6回收率试验 向阴性试样中添加标准溶液,均按上述步骤操作,测定后计算试样中添加的回收率。添加浓度及回 收率范围参见附录B中的表B.1。 8结果计算 被测物残留量的测定按式(1)计算: VV1000 X, = ci X ..(1) m^1000 式中: X,一试样中被测组分残留量,单位为微克每千克(μg/kg); c一一从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度;单位为纳克每毫升(ng/mL); V—样品溶液定容体积,单位为毫升(mL); m一一样品溶液所代表试样的质量,单位为克(g)。 计算结果应扣除空白值。 9精密度 9.1一般规定 本标准的精密度数据是按照GB/T6379.1和GB/T6379.2的规定确定的,其重复性和再现性的 值是以95%的可信度来计算。 9.2重复性 在重复性条件下,获得的两次独立测试结果的绝对差值不超过重复性限r,牛奶和奶粉中土霉素、 3
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