ICS 67.050 B 47 GR 中华人民共和国国家标准 GB/T23409—2009 蜂王浆中土霉素、四环素、 金霉素、强力霉素残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法 Determination of residues of oxytetracycline, tetracycline chlortetracycline, and doxycycline in royal jelly- LC-MS/MS method 2009-07-01实施 2009-03-28发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T23409—2009 前言 本标准的附录A、附录B和附录 C为资料性附录。 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国江苏出入境检验检疫局 GB/T23409—2009 蜂王浆中土霉素、四环素、 金霉素、强力霉素残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法 1范围 本标准规定了蜂王浆中四环素、土霉素、金霉素、强力霉素残留量的液相色谱-质谱/质谱测定方法。 本标准适用于蜂王浆中四环素、土霉素、金霉素、强力霉素残留量的测定。 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—2008，ISO3696：1987，MOD） 3方法提要 相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。 4试剂和材料 除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1甲醇：色谱纯。 4.2甲酸：色谱纯。 4.3三氯乙酸。 4.4氢氧化钠。 4.5甲醇-水：（2十8，体积比）：量取20mL甲醇（4.1)与80mL水混合。 4.6甲醇-水：（3+7，体积比）：量取30mL甲醇（4.1)与70mL水混合。 4.71%三氯乙酸水溶液：称取10g三氯乙酸于200mL水中，溶解后，加水至1L。 4.81.0mol/L磷酸氢二钠水溶液：称取358g磷酸氢二钠（NazHPO4·12HzO)于600mL水中，溶解 后，加水至1L。 4.9四环素（Tetracycline，CAS号：64-75-5）、土霉素（Oxytetracycline，CAS号：2058-46-0）、金霉素 （Chlortetracycline，CAS号：57-62-5）、强力霉素（Doxycycline，CAS号：24390-14-5）标准物：纯度 ≥95%。 4.10四环素、土霉素、金霉素、强力霉素药物标准储备溶液：1.0mg/mL。准确称取适量的四环素、土 霉素、金霉素、强力霉素药物标准物质，用甲醇配成1.0mg/mL的标准储备液。储备液贮存在一18℃ 冰柜中，可使用6个月。 4.11空白样品提取液：用不含四环素类药物残留的样品，按照7.1制备空白样品溶液。 4.12四环素、土霉素、金霉素、强力霉素药物标准工作溶液：用空白样品提取液（4.11）分别配成四环 素、土霉素、金霉素、强力霉素药物浓度为5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、 200ng/mL标准工作溶液，标准工作溶液在4℃保存，现用现配 1 GB/T23409—2009 4.13 3聚苯乙烯吡咯烷酮填料固相萃取柱或相当者：60mg，3mL。使用前分别用5mL甲醇和5mL 水预处理，保持柱体湿润。 4.14滤膜：0.45μm，水相。 5仪器与设备 5.1液相色谱-质谱仪（串联四极杆）：配有电喷雾离子源。 5.2 分析天平：感量分别为0.1mg和0.01g。 5. 3 自动浓缩仪或相当者 液体混匀器。 5. 4 5.5 真空泵：真空度大于或等于80kPa。 5.6 移液器：10mL。 5.7 离心管：50mL，具塞。 5. 8 刻度离心管：10mL。 5. 9 离心机：8000r/min。 6试样的制备与保存 6.1试样的制备 将实验室样品，自然解冻至室温，搅拌均匀，分出0.5kg作为试样。制备好的试样置于样品瓶中， 密封，并做上标记。在制样的操作过程中，应防止样品污染或发生残留物含量的变化。 6.2试样的保存 贮存在一18℃冰柜中。 7测定步骤 7.1提取 称取2g试样（精确到0.001g），置于50mL具塞离心管中，加人15mL1%三氯乙酸溶液（4.7）， 于液体混匀器上快速混合2min，6500r/min离心5min，取10mL上清液，用1mol/LNazHPO,（4.8） 调节pH值为6.0～7.0。将溶液以1mL/min左右的流速通过固相萃取柱，待溶液完全流出后，用 5mL水洗离心管并过柱，然后再用5mL甲醇-水（4.5）洗柱，弃去全部淋出液。在65kPa的负压下，减 压抽干10min，最后用5mL甲醇（4.1）洗脱，收集洗脱液于10mL刻度离心管（5.8）中，于50℃用氮气 吹干仪吹干，用甲醇-水（4.6)定容至1.0mL,过0.45μm的滤膜（4.14)到进样瓶中，供液相色谱-质谱 仪测定 7.2测定 7.2.1液相色谱条件 a) 色谱柱：高纯硅胶Cls柱，5μm，150mm×2.1mm（内径）或相当者； b) 流动相：0.1%甲酸水溶液十甲醇，梯度参见附录A； 流速：0.25mL/min； d) 柱温：室温； e） 进样量：25μL。 7.2.2质谱条件 参见附录B。 7.2.3液相色谱-质谱测定 四环素、土霉素、金霉素、强力霉素药物标准工作溶液（4.12)在液相色谱-质谱设定条件下分别进 样，以样品峰面积为纵坐标，工作溶液浓度（ng/mL）为横坐标，绘制6点标准工作曲线，用标准工作曲线 对样品进行定量，样品溶液中四环素、土霉素、金霉素、强力霉素药物的响应值均应在仪器测定的线性范 2 GB/T 23409—2009 围内。在上述色谱条件下，药物参考保留时间分别为四环素5.82min，土霉素6.05min，金霉素 6.96min，强力霉素7.75min。谱图参见附录C 7.2.4阳性样品的确证 按照上述（7.2.1~7.2.3）条件测定样品和标准工作液，如果检测的质量色谱峰保留时间与标准工 作液一致，允许偏差小于土2.5%；定性离子对的相对丰度与浓度相当标准工作液的相对丰度一致，相对 丰度偏差不超过表1的规定，则可判断样品中存在相应的被测物 表1定性测定时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 >50% >20%~50% >10%~20% ≤10% 允许的相对偏差 ±20% ±25% ±30% ±50% 7.3空白试验 除不称取试样外，均按上述（7.1～7.2)步骤进行。 8结果计算 结果按式(1)计算： (c -coi) X V X = .(1) m X 1 000 SZG 式中： X 试样中被测组分残留量，单位为毫克每千克（mg/kg）； 由标准曲线而得的样液中药物的含量，单位为纳克每毫升（ng/mL）； Ci 由标准曲线而得的空白试验中药物的含量，单位为纳克每毫升（ng/mL）； Coi V. 样品溶液定容体积，单位为毫升（mL）； 样品溶液所代表试样的质量，单位为克（g）。 m 9测定低限和回收率 9.1 测定低限 本标准测定低限：四环素、土霉素、金霉素、强力霉素均为0.005mg/kg。 9.2回收率 回收率见表2。 表2土霉素、四环素、金霉素、强力霉素添加浓度及其回收率范围的试验数据 药物名称 添加浓度/（mg/kg） 回收率范围/% 0.005 85.2~114.4 土霉素 0.010 93.6~120.2 0.040 88.6~120.8 0.005 92.2~115.4 四环素 0.010 76.4~103.0 0.040 73.5~100.1 0.005 107.0~123.6 金霉素 0.010 86.6~102.6 0.040 71.3~89.8 0.005 80.8~115.2 强力霉素 0.010 65.8~76.9 0.040 71.8~100.6 3