ICS 67.120 X 04 GP 中华人民共和国国家标准 GB/T 21981—2008 动物源食品中激素多残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法 Determination of hormone multiresidues in foodstuffs of animal originLC-MS/MS method 2008-06-06发布 2008-07-03实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 21981—2008 前言 本标准附录A和附录B为规范性附录,附录C、附录D、附录E、附录F和附录G均为资料性附录 本标准由中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局提出。 本标准由中华人民共和国国家认证认可监督管理委员会归口。 本标准起草单位：北京市疾病预防控制中心、中国疾病预防控制中心营养与食品安全所、中国检验 检疫科学研究院， 本标准主要起草人：邵兵、杨奕、张晶、吴永宁、储晓刚。 GB/T21981—2008 动物源食品中激素多残留检测方法 液相色谱-质谱/质谱法 1范围 本标准规定了动物源食品中激素残留量的液相色谱-质谱/质谱测定方法 本标准适用于猪肉、猪肝、鸡蛋、牛奶、牛肉、鸡肉和虾等动物源食品中50种激素（见附录A）残留的 确证和定量测定 2规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准， GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法（GB/T6682—1992，neqISO3696：1987） 3方法提要 试样中的目标化合物经均质，酶解，用甲醇-水溶液提取，经固相萃取富集净化，液相色谱-质谱/质 谱仪测定，内标法定量。 4试剂和材料 除特殊注明外，本标准所用试剂均为色谱纯，水为GB/T6682规定的一级水。 4.1甲醇。 4.2 二氯甲烷。 4.3乙腈。 4.4甲酸。 4.5 乙酸：分析纯。 4.6乙酸钠(NaAC·4H,O):分析纯。 4.7β-葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶溶液（β-glucuronidase/arylsulfatase）：4.5U/mLβ-葡萄糖醛酸 酶,14U/mL芳香基硫酸酯酶。 4.8乙酸-乙酸钠缓冲溶液（pH5.2）：称取43.0g乙酸钠（NaAC·4HO），加入22mL乙酸，用水溶 解并定容到1000mL，用乙酸调节pH到5.2。 4.110.1%甲酸水溶液：精确量取甲酸1mL加水稀释至1000mL。 4.12标准品：去甲雄烯二酮、群勃龙、勃地酮、氟甲罩酮、诺龙、雄烯二酮、罩酮、普拉雄酮、甲酮、异罩 酮、表雄酮、康力龙、17β-羟基雄烷-3-酮、美睾酮、达那唑、美雄诺龙、羟甲雄烯二酮、美雄醇、雌二醇、雌三 醇、雌酮、炔雌醇、已烷雌酚、已烯雌酚、已二烯雌酚、炔诺酮、21α-羟基孕酮、17α-羟基孕酮、左炔诺孕酮、 化可的松、泼尼松龙、氟米松、地塞米松、乙酸氟氢可的松、甲基泼尼松龙、倍氯米松、曲安奈德、氟轻松、 氟米龙、布地奈德、丙酸氯倍他索，纯度均大于97%。物质英文名称及CAS号见附录A。 1 GB/T21981—2008 4.13同位素内标：炔诺孕酮-d.、孕酮-d。、甲地孕酮乙酸酯-d、甲羟孕酮-d3、美仑孕酮-d3、炔诺酮-13C2、 氯睾酮乙酸酯-d3、氯睾酮-d3、16β-羟基司坦唑醇-d3、甲睾酮-d，、勃地龙-d3、氢化可的松-d3、睾酮-13C2、雌 酮-dz、雌二醇-13Cz、已烯雌酚-d.、已二烯雌酚-dz、已烷雌酚-d，物质英文名称见附录B 4.14标准储备液：分别准确称取10.0mg的标准品及内标于10mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至 刻度制成1.0mg/mL标准储备液，一18℃以下保存，标准储备液在12个月内稳定。 4.15混合内标工作液：用甲醇将各标准储备溶液配制成浓度为100ug/L的混合内标工作液。 4.16混合标准工作液：根据需要，用甲醇-水溶液（4.9）将各标准储备溶液配制为适当浓度（0.5，1，2， 5,10,20和40μg/L，其中炔诺酮、表雄酮、布地奈德、17β羟基雄烷-3-酮、氟米龙、氟甲睾酮为其他化合 物浓度的5倍），标准工作溶液中含各内标浓度为10μg/L。 （4.10）、6mL甲醇、6mL水活化 4.18氨基固相萃取柱（500mg，6mL），使用前用6mL二氯甲烷-甲醇溶液（4.10）活化 5仪器 5.1液相色谱-串联四极杆质谱仪：配有电喷雾离子源。 5.2电子天平：感量为0.0001g和0.01g。 5.3 组织匀浆机。 5.4涡旋混合器。 5.5恒温振荡器。 5. 6 超声清洗仪。 5.7 离心机：10000r/min。 5.8 固相萃取装置。 5.9 氮吹仪。 5.10 pH计。 5.11移液器。 6试样制备 6.1动物肌肉、肝脏、虾 从所取全部样品中取出有代表性样品约500g，剔除筋膜，虾去除头和壳。用组织捣碎机充分捣碎 均匀，均分成两份，分别装入洁净容器中，密封，并标明标记，于一18℃以下冷冻存放 6.2牛奶 从所取全部样品中取出有代表性样品约500g，充分摇匀，均分成两份，分别装入洁净容器中，密封， 并标明标记，于0℃～4℃以下冷藏存放 6.3鸡蛋 别装人洁净容器中，密封，并标明标记，于0℃～4℃以下冷藏存放。 注：制样操作过程中应防止样品被污染或其中的残留物发生变化。 7分析步骤 7.1提取 称取5g试样（精确至0.01g）于50mL具塞塑料离心管中，准确加入内标溶液（4.15）100uL和 10mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液（4.8），涡旋混匀，再加入β葡萄糖醛酸酶/芳香基硫酸酯酶溶液100μL，于 37℃士1℃振荡酶解12h。取出冷却至室温，加人25mL甲醇超声提取30min，0℃～4℃下 2 GB/T 21981—2008 10000r/min离心10min。将上清液转人洁净烧杯，加水100mL，混匀后待净化。 7.2净化 提取液（7.1)以2mL/min～3mL/min的速度上样于活化过的ENVI-Carb固相萃取柱（4.17）。将 小柱减压抽干。再将活化好的氨基柱串接在ENVI-Carb固相萃取柱下方。用6mL二氯甲烷-甲醇溶 液（4.10）洗脱并收集洗脱液，取下ENVI-Carb小柱，再用2mL二氯甲烷-甲醇溶液（4.10）洗氨基柱，洗 脱液在微弱的氮气流下吹干，用1mL甲醇-水溶液（4.9）溶解残渣，供仪器测定 8测定 8.1雄激素、孕激素、皮质醇激素测定 8.1.1液相色谱条件 a) 色谱柱：ACQUITYUPLCTMBEHCis柱，2.1mm(内径）X100mm，1.7μm，或相当者。 流动相：A，0.1%甲酸水溶液（4.11)；B,甲醇。梯度淋洗，参考梯度条件参见表C.1。 c) 流速：0.3mL/min。 d) 柱温：40℃。 e) 进样量：10μL。 8. 1. 2 雄激素、孕激素测定参考质谱条件 a) 电离源：电喷雾正离子模式。 b) 毛细管电压：3.5kV。 c) 源温度：100℃。 d) 脱溶剂气温度：450℃。 e) 脱溶剂气流量：700L/h f) 碰撞室压力：0.31Pa（3.1X10-3mbar）。 g) 雄激素、孕激素的特征离子参见表D.1和表D.2。 8. 1. 3 皮质醇激素测定参考质谱条件 a) 电离源：电喷雾负离子模式。 b) 毛细管电压：3.0kV。 c) 源温度：100℃。 d) 脱溶剂气温度：450℃。 e) 脱溶剂气流量：700L/h。 f) 碰撞室压力：0.31Pa（3.1×10-3mbar）。 g) 皮质醇激素的特征离子参见表D.3。 8. 2 雌激素测定 8.2.1雌激素测定液相色谱条件 a) 色谱柱：ACQUITYUPLCTMBEHCi：柱，2.1mm(内径）X100mm，1.7μm，或相当者。 b) 流动相：A，水；B,乙睛。梯度洗脱，参考梯度条件参见表C.2。 c) 流速：0.3mL/min。 d) 柱温：40℃。 e) 进样量：10μL。 8.2.2 雌激素测定质谱条件 a) 电离源：电喷雾负离子模式。 b) 毛细管电压：3.0kV。 c) 源温度：100℃。 脱溶剂气温度：450℃。 3