ICS 11.220 B 41 中华人民共和国国家标准 GB/T 40049—2021 鸡肠炎沙门氏菌PCR检测方法 PCR detection method of chicken salmonella enteritis 2021-11-01实施 2021-04-30发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T 40049—2021 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业农村部提出。 本标准由全国动物卫生标准化技术委员会（SC/TC181)归口。 本标准起草单位：山东农业大学、青岛农业大学、中国动物卫生与流行病学中心、山东省农业科学院 家禽研究所、秦皇岛海关、山东派克检测技术有限公司。 本标准主要起草人：常维山、孙淑红、王述柏、翟海华、崔言顺、柴同杰、鞠孜敬、赵效南、王涛、黄兵 宋敏训、马秀丽、高月花、郑德云、郭树源、马洪超、孙杰、张富友 1 GB/T 40049—2021 鸡肠炎沙门氏菌PCR检测方法 1范围 本标准规定了鸡肠炎沙门氏菌分子分型的PCR检测方法。 本标准适用于各种日龄的鸡及其产品中携带的肠炎沙门氏菌的PCR方法检测。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB4789.4一2016食品安全国家标准食品微生物学检验沙门氏菌检验 GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法 GB/T28642一2012饲料中沙门氏菌的快速检测方法 聚合酶链式反应（PCR）法 NY/T541—2016兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 持家基因 house-keepinggene 生物体在生理、病理和不同发育阶段的在所有类型的细胞中都表达的一类基因。这类基因高度保 守，基因产物对于维持细胞的基本结构和代谢功能是必不可少的 4缩略语 下列缩略语适用于本文件。 DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid) PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction） 5试剂和材料 5 除另有规定外，所用试剂均为分析纯。实验用水均符合GB/T6682一2008二级水规定。 5.1LB液体培养基（配制方法见附录A中A.1) 5.2 缓冲蛋白陈水（BPW)前增菌液（配制方法见A.2）。 5.3 亚硒酸盐胱氨酸（SC）增菌液（配制方法见A.3）。 5.4 四硫磺酸盐煌绿（TTB)增菌液（配制方法见A.4）。 木糖赖氨酸脱氧胆盐（XLD)琼脂D.3（配制方法见A.5）。 5.6 TAE电泳缓冲液（配制方法见A.6）。 5.7 阳性、阴性对照：阳性对照为肠炎沙门氏菌标准株（CVCC3377）培养液、鸡白痢沙门氏菌标准株 1 GB/T40049—2021 （CVCC535）培养液；阴性对照为灭菌超纯水。 5.8 细菌基因组DNA提取试剂盒：商品化试剂盒。 5.9 9无水乙醇：-20℃预冷 5.1075%乙醇：无水乙醇和双蒸水配制，一20℃预冷 5.11DNA分子量标记：DNAMarker2000。 5.12 琼脂糖。 5.13 七个持家基因片段的PCR引物序列：参见附录B的B.1。 5.14 2XPCRMix。 6仪器 6.1 恒温培养箱（温度范围：5℃～50℃，温度均匀度：≤土1℃）。 6.2 高压灭菌锅（灭菌温度：105℃～135℃，工作压力：≤0.35MPa）。 6.3 电子天平（感量0.001g）。 6.4 高速离心机（可控温至4℃、离心速度可达12000r/min以上）。 6.5 二级生物安全柜。 6.6 4℃冰箱（温控范围2℃~8℃）；一20℃冰箱。 6.7 PCR仪。 6.8 电泳仪（电压90V～120V）。 6.9 微量移液器（2μL、20μL、200μL、1000μL）及配套吸头。 6.10 电泳仪（电压90V~120V)。 6.11 控温摇床（温度范围：5℃～50℃，振荡频率：30r/min～300r/min）。 6.12 凝胶成像仪。 6.13 PCR反应管。 6.14 1.5mL带盖离心管。 7沙门氏菌分离鉴定 7.1木 样品采集、储存和运输 7.1.1组织样品 选择具有典型临床症状的病死鸡，无菌取其肝脏、脾脏等组织样品，放置于无菌容器内，标记好组织 名称和采样日期，冷藏运送到实验室进行检测。按照NY/T541一2016中6.2执行。 7.1.2肠内容物样品 按照NY/T541—2016中6.7.2执行。 7.1.3粪便样品 按照NY/T541—2016中6.8.1执行。 7.1.4泄殖腔拭子样品 按照NY/T541—2016中6.8.2执行。 2