ICS 07.080 A 40 中华人民共和国国家标准 GB/T 34777—2017 中国仓鼠卵巢（CHO)细胞表达产品 残留DNA检测 荧光定量PCR法 Detection of residual DNA in biological product which expressed from Chinese hamster ovary(CHO) cell- Fluorescent quantitative polymerase chain reaction assay 2018-05-01实施 2017-11-01 发布 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 34777—2017 前言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草， 本标准由全国生化检测标准化技术委员会（SAC/TC387)提出并归口。 本标准起草单位：信达生物制药（苏州）有限公司、中国测试技术研究院生物研究所。 本标准主要起草人：孙左宇、周李华、李雪峰、黄晓刚、袁志军、郭燕红。 GB/T 34777—2017 中国仓鼠卵巢（CHO）细胞表达产品 残留DNA检测荧光定量PCR法 1范围 本标准规定了检测残留宿主DNA的荧光定量PCR法。 本标准适用于CHO（中国仓鼠卵巢细胞）宿主细胞系表达的生物制品的残留宿主DNA的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 Ct 值 cyclethreshold 每个反应管内荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数， 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 CHO：中国仓鼠卵巢（ChineseHamsterOvary） 5原理 物，包括正向引物：ForwardPrimer（5'-CCAGGCATTGGTGGCAC-3'）和反向引物：ReversePrimer (5'-AGACAGGGTTTCTCTGT-3')。 采用SYBR荧光定量PCR（FQ-PCR）法，采集荧光绘制出的PCR扩增曲线Ct值，与扩增体系中起 始目的基因模板的对数值呈反比，以起始模板DNA对数值为纵坐标，Ct值为横坐标，制作标准曲线 根据标准曲线方程计算样品的DNA残留量，从而达到定量检测样品残留DNA的含量自的。 6 仪器设备 6.1荧光定量PCR仪：含有SYBR荧光染料检测通道。 6.2紫外-可见分光光度计：波长范围：200nm~760nm。 6.3微型离心机：转速范围：2000r/min~23000r/min。 1 GB/T34777—2017 6.4电热恒温水浴锅：室温至100℃；温度波动范围：士0.5℃温度显示精度：0.1℃。 6.5生物安全柜/超净工作台。 7试剂或材料 除非另有说明，本方法中仅使用分析纯试剂，水为GB/T6682规定的一级水。试剂盒的组成与相 关试剂的配制方式参见相应的厂家说明书。 7.1基因组提取试剂盒。 7.2基因组纯化试剂盒。 7.3DNA提取试剂盒。 PCR反向引物:ReversePrimer(5'-AGACAGGGTTTCTCTGT-3'合成PAGE级）。 7.5 限制性内切酶：EcoRI。 7.6DNA标准品。 7.7染料法荧光定量试剂盒。 7.8蛋白酶K(ProteinaseK)。 7.9 异丙醇（AR）。 7.10无水乙醇（AR）。 8试验步骤 8.1DNA提取 8.1.1待测样品残留DNA的提取制备 用超纯水将待测样品稀释至蛋白浓度为1mg/mL~20mg/mL，取100μL稀释后的样品，参照 DNA提取试剂盒的说明书，进行残留DNA的提取。 8.1.2阳性对照样品DNA的提取制备 用超纯水将待测样品稀释至蛋白浓度为1mg/mL～20mg/mL，取100μL稀释后的样品，加入20μL 100pg/mL的DNA标准品，参照DNA提取试剂盒的说明书，进行残留DNA的提取。 8.1.3阴性对照样品DNA的提取制备 释后的样品，参照DNA提取试剂盒的说明书，进行残留DNA的提取。 8.2PCR扩增检测 8.2.1DNA标准品工作液的制备 取DNA标准品，分别稀释至100ng/mL、10ng/mL、1ng/mL、100pg/mL、10pg/mL、1pg/mL和 0.1pg/mL等系列浓度，用于标准曲线的制备。 8.2.2Real-timePCR条件及体系 按表1进行反应体系的配制，各样品制备3个复孔，加样过程先将除DNA模板（即供测试的样品） 以外的各组分预混合，16uL/孔，最后加入标准品/待测样品/阴性对照/阳性对照DNA9L/孔，加好 2