ICS 65.020.30 B 43 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 26938—2011 牛胚胎生产技术规程 Standard for production technology of bovine embryo 2011-09-29发布 2012-02-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 26938—2011 前言 本标准的附录A为规范性附录,附录B、附录C、附录D为资料性附录。 本标准由中华人民共和国农业部提出 本标准由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC274）归口。 本标准起草单位：内蒙古自治区家畜改良工作站。 本标准主要起草人：高雪峰、张立、包呼格、韩锦龙、李忠书、陈巴特尔、黄春华、包和平、德庆 刘长海。 1 GB/T26938—2011 牛胚胎生产技术规程 1范围 本标准规定了供体牛的选择与饲养管理、超数排卵及配种、牛非手术冲胚及胚胎质量鉴定、胚胎的 冷冻与保存等技术规程。 本标准适用于牛体内胚胎生产技术操作。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有 的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB4143牛冷冻精液 GB/T5458液氮生物容器 3术语和定义 下列术语和定义适用于本标准。 3. 1 供体牛donor 可用于胚胎生产的母牛。 4供体牛的选择与饲养管理 4.1供体牛的选择条件 4.1.1品种优良，符合品种外貌特征，生产性能好。 4.1.2遗传性能稳定，谱系清楚。 4.1.3年龄以14月龄至10岁为宜。 4.1.4无流产史，产后空怀90d以上，有两次以上正常发情周期。 4. 1. 5 体质健壮，生殖器官和繁殖机能正常，无遗传和传染性疾病。 4.2供体牛的饲养管理 4.2.1保持饲养环境卫生、温湿度适宜，避免应激反应 4.2.2制定合理的日粮配方。 4.2.3满足清洁卫生的饮水需要。 4.2. 4 超排前8周加强饲养管理，并适量补充维生素A、维生素D、维生素E和微量元素。 5供体牛的超数排卵及配种 5.1超数排卵 5.1.1供体牛的同期发情处理 5.1.1.1药品 所用药品见附录A。 1 GB/T26938—2011 5.1.1.2同期发情方法 5.1.1.2.1肌肉注射PG法 第一次注射：在任意一天。 第二次注射：在第一次注射后第11天。第二次注射后24h～96h时观察发情。 5. 1. 1. 2.2 CIDR 法 选定任意一天放入CIDR（含孕激素阴道栓）。 5.1.2超数排卵方法 以母牛自然发情、PG法发情或放CIDR之日作为发情周期第0天，在9d～13d中的任意一天开始 注射FSH，每天早、晚各注射1次，间隔12h连续4d递减注射。放CIDR的供体，在第8次注射FSH 之后，取出CIDR。具体方法参见附录B。 5.1.3重复超数排卵 重复超排间隔时间一般为45d～60d，方法同5.1.2。 5.1.4供体牛发情鉴定 在第8次注射FSH之后，对超数排卵供体牛，每隔6h观察一次，每次0.5h以上。以母牛稳定站 立接受其他牛爬跨或直肠检查作为发情的准确时间 5.2配种 5.2.1对种公牛的要求 谱系清楚，检疫合格，遗传性能稳定，生产性能优良。 5.2.2配种所需器材 配种所需器材见附录A。 5.2.3人工输精操作要求 5.2.3.1母牛外阴部应经过清洗消毒。 5.2.3.2输精枪应保持无菌。 5.2.3.3冷冻精液质量符合GB4143的规定。 5.2.4配种时间 确认发情12h后，进行第一次输精，间隔12h进行第二次输精，每次输精1支～2支，共输 精2次～3次。 6牛非手术胚胎采集及胚胎质量鉴定 6.1非手术胚胎采集 6.1.1非手术胚胎采集所需主要器材 非手术胚胎采集所需主要器材见附录A。 6.1.2非手术胚胎采集所需药品 非手术冲胚所需药品见附录A。 6.1.3改进的磷酸盐缓冲液的配制 改进的磷酸盐缓冲液（PBS）配方参见附录C。 6.1.4非手术胚胎采集时间 供体牛超排发情后7d士0.5d采集胚胎。 6.1.5非手术胚胎采集步骤 6.1.5.1将供体牛稳定，用2%利多卡因在荐椎和第一尾稚结合处或第一尾椎和第二尾椎结合处进行 尾椎硬膜外麻醉，利多卡因用量宜每头5mL。 6.1.5.2麻醉后将牛尾固定，清除直肠宿便，阴部及外阴清洗消毒 6.1.5.3用扩宫棒扩张子宫颈，然后插人宫颈黏液器将黏液抽出，随后把带内芯的冲胚管慢慢插入子 2 GB/T26938—2011 宫角，当冲胚管到达子宫角弯曲处，拔出内芯5cm左右，再把冲胚管往子宫角前端推进，至冲胚管到达 子宫角前端1/3~1/2处。 6.1.5.4冲胚管先充一定气体，待确定气囊位置后，再充气至冲胚管固定为宜。 6.1.5.5抽出冲胚管内芯。 6.1.5.6连接冲胚管。 6.1.5.7用50mL注射器每次吸取30mL~40mL冲卵液，夹住三通导管的输出管，将PBS从输人管 注入子宫角，然后夹住输人管，使回收液从输出管流到集卵杯（500mL容量），反复冲洗，每个子宫角用 400mL~500mL的PBS溶液。 6.1.5.8把集卵杯内的回收液在温室（20℃～25℃）下，用集卵漏斗过滤，最后保留10mL左右液体， 倒入$100mm培养皿中，进行镜检 6.1.5.9两侧子宫角胚胎采集完成后，将气囊空气放出，冲胚管抽至子宫体，注人青霉素、链霉素等抗 菌素或预防子宫炎的药物。 6.1.5.10肌肉注射或宫内输入前列腺素或类似物。 6.2胚胎的检出与质量鉴定 6.2.1检胚 把盛有回收液的培养皿放在体视显微镜下，在培养皿底划线分区，逐区检查，检出胚胎放入保存液 中保存。 6.2.2胚胎的发育期鉴定 超数排卵后的供体牛在发情后7d王0.5d时，胚胎处于以下发育期：案椹胚（M）、致密案椹胚 （CM）、早期囊胚（EB）、囊胚（B）、扩张囊胚（EXB）。做好采胚记录。供体牛胚胎采集、保存记录表参见 附录D。 6.2.3胚胎质量鉴定 用形态学方法进行胚胎质量鉴定，将胚胎依次分为A、B、C、D四级 A级：透明带完整无缺陷、薄厚均匀，胚龄与发育阶段相一致，卵裂球轮廓清楚，透明度适中，细胞 密度大，卵裂球均匀，无游离细胞或很少，变性细胞比例少于10%。 B级：透明带完整无缺陷、薄厚均匀，发育阶段基本符合胚龄，轮廓清楚，明暗度适中或稍暗或稍浅， 细胞密度较小，卵裂球较均匀，有小部分游离细胞，变性细胞比例为10%～20%。 C级：透明带完整或有缺陷，轮廓不清楚，色泽过暗或过淡，细胞密度小，突出细胞占一多半，细胞变 性率为30%~40%。 D级：透明带完整或有缺陷，胚胎发育停滞、变性、卵裂球少而散，为不可用胚胎。 7胚胎的冷冻与保存 7.1胚胎的冷冻 7.1.1胚胎冷冻所需器材 胚胎冷冻所需器材见附录A。 7.1.2胚胎冷冻所需溶液 胚胎冷冻所需溶液见附录A。 7.1.3胚胎冷冻操作步骤 7.1.3.1胚胎的洗涤 A级、B级胚胎冷冻前在保存液洗涤10次～12次。 7.1.3.2胚胎的平衡 将洗涤后的胚胎放人冷冻液中，室温下平衡15min~20min。 3