ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 27537—2011 动物流感检测 A型流感病毒分型基因 芯片检测操作规程 Animal influenza detectionProtocol of DNA microarray examination for influenza A virus subtypes 2011-11-21发布 2012-03-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 27537—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中国人民解放军军事医学科学院、中国兽医药品监 察所。 本标准主要起草人：韩雪清、刘伯华、李建、林祥梅、干慧煜、刘建、陈茹、侯义宏、刘业兵、贾广乐、 吴绍强、梁成珠、秦智锋、宁宜宝、薄清如、王伊琴。 I GB/T27537—2011 动物流感检测A型流感病毒分型基因 芯片检测操作规程 1范围 本标准规定了A型流感病毒分型基因芯片检测的操作规程。 本标准适用于口岸样品中A型流感病毒全部亚型（H1～H16,N1～N9）的筛查。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 3缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ctrl、ctr2和ctr3：质控探针1、2和3(control1、control2andcontrol3) DEPC：焦碳酸二乙酯（diethylpyrocarbonate） dNTP：脱氧核苷酸三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate） PBS：磷酸盐缓冲盐水（phosphatebuffersolution） RNA：核糖核酸（ribonucleicacid) RT-PCR：反转录聚合酶链反应（reversetranscriptionpolymerasechainreaction) SDS：十二烷基磺酸钠（sodiumdodecylsulfate） SSC：氯化钠/柠檬酸钠缓冲液（sodiumchloride-sodiumcitratebuffer） TAMRA：羧基四甲基若丹明（carboxytetramethylrhodamine) 4主要试剂和仪器 4.1主要试剂 4.1.1试验用水 蒸馏水，按照GB/T6682，三级用水，除另有规定外，所用生化试剂均为分析纯， 4.1.2提取试剂 Trizol试剂等或商品化的病毒RNA提取试剂。 4.1.3A型流感病毒多重不对称RT-PCR扩增引物和探针的合成 特异性引物和探针（参见附录A）。探针和引物合成后，采用无RNA酶的水（参见附录B)分别溶解 为50μmol，一20℃保存备用。 1 GB/T 27537—2011 4. 1. 4 RT-PCR反应试剂 一步法RT-PCR缓冲液，dNTP，酶混合物，RNA酶抑制剂等 4.1.5基因芯片 含有A型流感病毒16个HA亚型和9个NA亚型特异性探针和质控探针，参见附录C。 4.1.6基因芯片杂交液 商品化的基因芯片杂交液（参见附录B），每份含有ddH,O0.7μL，20×SSC1.5L， 50XDenhardts1.5μL，50%（质量体积比）硫酸葡聚糖3.0μL，4%（质量体积比）SDS1.5μL，共 8.2μL/份。 4. 1. 7 杂交质控探针 TAMRA荧光标记的一段寡核昔酸（ctrl），与芯片上杂交阳性参照（PC，ctr2）序列互补，用于质控 杂交过程（序列参见附录A）。合成后，采用无RNA酶的水溶解为50umol/L，一20℃保存备用。 4.2仪器 4.2. 1 微型台式高速冷冻离心机（大于13000r/min）。 4. 2. 2 PCR仪。 4.2.3 涡旋混匀器。 4.2.4 恒温水浴箱。 4.2.5 芯片杂交盒。 4.2. 6 脱色摇床。 4.2.7 基因芯片扫描仪。 4.2.8 °（三0080。070。8~2) 4.2.9 微量可调移液器。 4.2.10 离心管和枪头。 5 操作方法 5.1 采样工具 下列采样工具应经（121土2）℃，15min高压灭菌并烘干： 棉拭子； 一剪刀； 镊子； 1.5mL离心管； 研钵。 5.2样品采集 5.2.1活动物 取鼻拭子、咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下： 取鼻拭子时将拭子深入鼻腔来回刮2次～3次并旋转，取鼻腔分泌液； 取咽喉拭子时将拭子深人喉头口及上颚裂来回刮2次3次并旋转，取咽喉分泌液； 2 GB/T27537—2011 一取泄殖腔拭子时将拭子深人泄殖腔旋转一圈并沾取少量粪便； 一将采样后的拭子分别放人盛有1.0mLPBS的1.5mL离心管中，加盖、编号。 5.2.2脏器或肌肉组织 用无菌镊子和剪刀等工具采集待检脏器或肌肉组织，装人一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号。 5.3样品购运 样品采集后，放人密闭的塑料袋内（一个采样点的样品放一个塑料袋），于保温箱中加冰、密封，24h 内送实验室。 5.4样品的处理 5.4.1棉拭子处理方法 样品在混匀器上充分混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，室温放置30min，取上清液转 入无菌的1.5mL离心管中，编号备用。 5.4.2肌肉或组织脏器处理方法 取待检样品2.0g，加人等量灭菌石英砂，于洁净、灭菌并烘干的研钵中充分研磨，加人10mLPBS 混匀，4℃，3000r/min离心15min，取上清液转入无菌的1.5mL离心管中，编号备用。 5.5样品RNA的制备 5.5.1取上清液200μL，分别加人1.5mL离心管内，各加人Trizol试剂1.0mL，反复混匀，冰上放置 5min。 5.5.2加人200μL氯仿，小心盖上帽盖，用力摇动离心管15s，室温放置5min。 5.5.312000r/min，4℃，离心15min，可见分为三层，上层水相含RNA。 5.5.4转移水相至一新离心管内，加人等量异丙醇，混匀，室温放置15min。 5.5.512000r/min，4℃，离心10min，离心后在离心管边和底部可见有胶样RNA沉淀（对于细胞毒 而言，可能看不到沉淀）。 5.5.6小心吸弃上清，加人500μL75%乙醇（用DEPC水配制），小心颠倒以漂洗沉淀及管壁， 12000r/min,4℃,离心5min。 5.5.7小心吸弃上清，室温干燥RNA沉淀5min~10min。然后加人20μL无RNA酶的水溶解沉 淀。提取的RNA应在2h内进行RT-PCR扩增，若需长期保存，应放置一80℃冰箱保存。 5.6A型流感病毒RNA多重不对称RT-PCR扩增体系 5.6.1引物混合比例 25对引物分为4组。第1组包括H1、H3、H5、H6、H7、H9、N1和N2.其中H5和H7亚型的上游 引物为0.65μL，下游引物为1.3μL,N2亚型的上游引物为0.6uL，下游引物为1.2μL，其余亚型的上 游引物均为0.5μL，下游引物均为1μL；第2组包括H2、H4、H8、H10、H11、H13、H15和H16，每个亚 型的上游引物均为0.5uL，下游引物均为1uL；第3组包括H14、N4、N6、N7和N9，其中N7上游引物 为0.65μL，下游引物为1.3μL,其余亚型上游引物均为0.5μL，下游引物均为1μL；第4组包括H12、 N3、N5和N8，其中N5上游引物为0.6μL，下游引物为1.2μL，其余亚型上游引物均为0.5μL，下游 引物均为1μL。 5.6.2RT-PCR反应体系 每个样品分4个管进行RT-PCR。在0.2mLPCR反应管中依次加人一步法RT-PCR缓冲液 3 SAG