ICS 11. 220 B 41 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 27982—2011 小反鱼兽疫诊断技术 Diagnostic techniques for peste des petits ruminants 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 27982—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国农业部提出。 本标准由全国动物防疫标准化技术委员会（SAC/TC181）归口。 SIc本标准起草单位：农业部热带亚热带动物病毒学重点实验室、中国动物卫生与流行病学中心、中国 检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：包静月、吴晓东、王志亮、李林、刘春菊、干清华、赵文姬、邹艳丽、郑东霞、徐天刚、 李金明、姚李四、张乐、林祥梅、吴绍强、韩雪清 I GB/T 27982—2011 小反鱼兽疫诊断技术 1范围 本标准规定了小反鱼兽疫的临床诊断和实验室诊断的技术要求。 本标准适用于小反台兽疫的诊断。 规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 SAG 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB19489一2008实验室生物安全通用要求 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3. 1 荧光定量反转录-聚合酶链式反应 real time quantitative reversetranscription polimerase chain re- action 荧光定量RT-PCR反应 在RT-PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个RT-PCR进程，最后通过 标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 3. 2 荧光域值 threshold 荧光定量RT-PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是 3个15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。 3.3 Ct 值 Ct value 每个反应管内的荧光信号到达设定的荧光域值时所经历的循环数。 4生物安全措施 进行小反乌兽疫实验室检测时，如病毒分离、血清处理等，按照GB19489一2008。 5临床诊断 5.1临床症状 5.1.1突然发热，第2天～第3天体温达40℃~42℃高峰。发热持续3d左右，病羊死亡多集中在发 热后期。 1 GB/T27982—2011 由于鼻孔被凸起的结干的鳞屑覆盖，动物打喷嚏和咳嗽。呼吸急促，呼吸困难，排痰性咳嗽和眼晴的卡 他性分泌物。 落后形成界线分明的浅糜烂斑。上皮破损偏好部位为嘴唇、齿龈、牙板、舌头以及母羊阴户的阴唇表面。 口腔破损可能伴有大量流涎。 SZIC 5.1.4发热2d～3d后病畜开始腹泻，伴随严重脱水、消瘦、虚脱。怀孕母羊可发生流产。 5.1.5特急性病例在发热开始的4d～6 d内死亡。亚临床型病例症状较轻,病畜在生病10d～14 d 以后康复。 5.2病理变化 5.2.1嘴唇充血，口腔破损程度不等，较轻的只有一处溃疡，严重的出现广泛的溃疡性及坏死性口腔 炎，涉及牙板、硬聘、颊粘膜和乳突和舌头喙部背面。粘膜病变可延伸至咽部，偶尔在网胃和瘤胃交 界处。 5.2.2上呼吸道粘膜可能严重充血，伴有鼻孔和气管的溃疡。支气管肺炎，肺尖肺炎， 5.2.3皱胃粘膜出现严重的充血和溃烂。偶尔，整个肠道出现弥散性的充血，但是，多数情况仅局限于 十二指肠、回肠、盲肠和结肠上部分。常见回盲肠瓣膜出血。大肠纵向折叠顶部偶尔出现严重的出血形 成斑马样条纹。 5.2.4肠淋巴组织坏死、菱陷。肠系膜淋巴组织轻微肿大、水肿，脾可能肿胀。上呼吸道粘膜可能严重 充血，伴有鼻孔和气管的溃疡。支气管肺炎，肺尖肺炎。肺部淋巴结肿胀并水肿。 5.2.5结膜出现脓性结膜炎。肾和膀胱可见充血。母羊可见阴户和阴道糜烂。 5.2.6组织学上可见肺部组织出现多核巨细胞以及细胞内嗜酸性包含体 5.3结果判定 山羊或绵羊出现上述临床症状和病理变化，羊群发病率、病死率较高，传播迅速，可判定为疑似小反 台兽疫。 6实验室诊断 6.1样品采集与运输 6.1.1样品的采集 6.1.1.1每个发病羊群最少选择5只病畜采集样品。 6.1.1.2选择处于发热期（体温40℃～41℃）、排出水样眼分泌物、出现口腔溃疡、无腹泻症状的活畜 采集样品。采集结膜棉拭子2个、鼻粘膜棉拭子2个、颊部粘膜棉拭子1个，分别放在300μL灭菌的 0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)中。无菌采集血液10mL,用常规方法分离血清。 6.1.1.3选择刚被扑杀或者死亡时间不超过24h的病畜采集组织样品。无菌采集肠系膜和支气管淋 巴结各3个~4个，脾、胸腺、肠粘膜和肺等组织各约25g~50g，分别置于50mL离心管中。 6.1.1.4肉制品取25g~50g，置于50mL离心管中。 6.1.2样品的运输与储存 6.1.2.1样品采集后，置冰上冷藏送至实验室检测。 6.1.2.2血清储存应置于一20℃冰箱。 GB/T 27982—2011 6.1.2.3棉子、病料组织和肉制品储存应置于一70℃冰箱。 6.2器械与设备 5%二氧化碳培养箱，DNA热循环仪，低温高速离心机，电泳仪和电泳槽，凝胶成像系统或者紫外检 测仪，实时荧光定量PCR仪，96孔高吸附性酶标板，洗瓶或者洗板机，恒温箱，酶标仪 6.3病毒分离与鉴定 6.3.1试验材料 非洲绿猴肾（Vero)细胞，pH7.4磷酸盐缓冲液（PBS)（见A.1），细胞培养液（见A.3），细胞培 养瓶。 6.3.2样品处理 棉拭子充分捻动、挤干后弃去拭子，加人青霉素至终浓度200IU/mL，加人链霉素至终浓度 200μg/mL。37℃作用1h。3000g离心10min，取上清液300μL作为接种材料。 用灭菌的剪刀、镊子取大约0.5g组织样品或肉制品，置于研钵中，剪碎，充分研磨，加人5mL灭菌 的0.01mol/LpH7.4磷酸盐缓冲液（含青霉素200IU/mL，链霉素200μg/mL)，制成1：10悬液。 37℃作用1h。3000g离心10min，取上清液5mL作为接种材料。 不能立即接种者，应将上清放一70℃保存。 6.3.3样品接种 取样品上清液接种已长成单层的Vero细胞，37℃恒温箱中吸附2h，加入细胞培养液，置5%二氧 化碳培养箱37℃培养。 6.3.4观察结果 接种后5d内，细胞应出现细胞病变效应，表现为细胞融合，形成多核体。如接种5d～6d后不出 现细胞病变，应将细胞培养物盲传三代。 6.3.5病毒的鉴定 将出现细胞病变的细胞培养物，按“6.4RT-PCR方法”和“6.5荧光定量RT-PCR反应”做进一 步鉴定。 6.3.6结果判定 样品出现细胞病变，而且RT-PCR方法或实时荧光RT-PCR方法鉴定结果阳性，则判为小反台兽 疫病毒分离阳性，表述为检出小反乌兽疫病毒。 否则，表述为未检出小反乌兽疫病毒。 6.4RT-PCR方法 6.4.1试剂与材料 除另有规定外，试剂为分析纯或生化试剂。实验用水符合GB/T6682的要求。 TRIzol试剂，三氯甲烷，异丙醇，无水乙醇，DEPC处理过的水（见附录B），反转录酶/TaqDNA聚 合酶混合液，2×一步法RT-PCR反应缓冲液，1.5%的琼脂糖凝胶（见附录B），0.5×TBE缓冲液（见附 录B)，溴化乙锭。 3