ICS 65. 020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 28071—2011 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法 Detection and identification of cucumber green mottle mosaic virus 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 28071—2011 前言 本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、中华人民共和国广东出入境检验检疫 局、中国检验检疫科学研究院。 本标准主要起草人：陈青、陈红运、廖富荣、林石明、吴冰冰、冯黎霞、张永江。 GB/T 28071—2011 黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了黄瓜绿斑驳花叶病毒检疫鉴定方法 黄瓜绿斑驳花叶病毒基本信息 中文名：黄瓜绿斑驳花叶病毒。 学名:cucumber green mottle mosaic virus。 缩写：CGMMV。 属烟草花叶病毒属Tobamoirus成员 CGMMV可通过接触传播，也可通过种子传播。蚜虫等常见瓜类病毒的传播介体不能传播 CGMMV。嫁接等农事操作是田间病害流行的主要因素之一。植株一且发病，如果未进行杀灭处理，土 壤也可带毒，带毒土壤也可成为病害发生的侵染源。 黄瓜绿斑驳花叶病毒的其他信息参见附录A。 3方法原理 通过基于抗原抗体反应的双抗夹心酶联免疫吸附测定（DAS-ELISA）、体外反转录和体外DNA合 成技术的反转录聚合酶链式反应（RT-PCR），并根据生物学特性进行检测鉴定。 4仪器设备、用具及试剂 4.1仪器设备 洗板机、酶联检测仪、高速冷冻离心机、电子天平（感量0.001g）、超净工作台、旋涡混合仪、PCR 仪、实时荧光PCR仪、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪、隔离温室、榨汁机、水浴锅。 4. 2 用具 微量移液器（0.5μ2μ，10μ，20μL，100μ，200μ，1000μ）、化学PGR反应管和（或）96孔 光化学PCR反应板、酶联板、研钵。 4.3试剂 4.3.1酶联测定试剂(见附录B)。 4.3.2RT-PCR检测试剂(见附录C)。 4.3.3实时荧光RT-PCR检测试剂（见附录D)。 4.3.4生物学测定（参见附录E)。 1 GB/T28071—2011 5样品制备 5.1种子样品制备及检疫鉴定 挑取500粒种子（重点挑取畸形、不成熟的种子）播于灭菌土中，待长出3片～4片叶后将表现症状 的植株编号，未表现症状的植株分组（10株为1组）并编号。采集的叶片分成两份，分别用于酶联测定 和分子生物学检测。 也可以挑取畸形、不成熟的种子直接进行酶联测定和分子生物学检测 5.2苗木检验鉴定 有症状的苗木单独检测。没有症状的分组检测，分组方法和检测方法同5.1。 5.3植物产品的检验鉴定 植物产品有症状的部分（如：果实上的畸形、斑驳等）单独检测。没有症状或无法观察症状的植物产 品，应按比例取样，检测方法为酶联测定和分子生物学检测 6检测方法 6.1双抗体夹心酶联免疫吸附测定 样品平行加到两个孔中。健康的植物组织作阴性对照，感染CGMMV的植物组织作阳性对照，样品提 取缓冲液作空白对照，其中阴性对照种类和材料（如种子或叶片)应尽量与检测样品一致 具体操作见附录B。 6.2RT-PCR检测 分别提取样品和对照的总RNA，反转录合成cDNA后，进行PCR扩增。健康的植物组织作阴性对 照，感染CGMMV的植物组织作阳性对照，用超纯水作空白对照 具体操作见附录C。 6.3实时荧光RT-PCR检测 分别提取样品和对照的总RNA，进行实时荧光RT-PCR检测。健康的植物组织作阴性对照，感染 CGMMV的植物组织作阳性对照，超纯水作空白对照。 具体操作见附录D。 6.4生物学接种试验 参见附录E。 7结果判定 6.1、6.2、6.3、6.4中如果两种方法的检测结果为阳性，即可判断该批种子或苗木携带黄瓜绿斑驳 花叶病毒。一般是酶联测定为阳性后，RT-PCR或实时荧光RT-PCR检测结果为阳性即可判断为携带 黄瓜绿斑驳花叶病毒。必要时可进行生物接种试验 2 GB/T28071—2011 8 样品保存 经检验确定携带黄瓜绿斑驳花叶病毒的样品应在合适的条件下保存，种子保存在4℃，病株在 一20℃或者一80℃冰箱中保存，做好标记和登记工作。 结果记录与资料保存 完整的实验记录包括：样品的来源、种类、检测时间、地点、方法和结果等，并要有经手人和检测人员 的签字。酶联测定应有酶联板反应原始数据，RT-PCR检测应有扩增结果图片，生物学接种应有症状 照片。 3