ICS 65.020.01 B 16 GB 中华人民共和国国家标准 GB/T 28094—2011 芒果细菌性黑斑病菌检疫鉴定方法 Detection and identification of Xanthomonas campestris pv mangiferaeindicae (Patel et al. ) Robbs et al. 2011-12-30发布 2012-06-01实施 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局 发布 中国国家标准化管理委员会 GB/T 28094—2011 前言 本标准按照GB/T1.1一2009给出的规则起草。 本标准由全国植物检疫标准化技术委员会（SAC/TC271）提出并归口。 疫局。 本标准主要起草人：刘鹏、罗加凤、崔汝强、魏亚东、王金成、刘勇、赵立荣、黄国明。 I GB/T 28094—2011 芒果细菌性黑斑病菌检疫鉴定方法 1范围 本标准规定了芒果细菌性黑斑病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于芒果果实、苗木等植物材料中芒果细菌性黑斑病菌的检疫和鉴定。 规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 SN/T1193基因检验实验室技术要求 SN/T2122 进出境植物及植物产品检疫抽样 3芒果细菌性黑斑病菌基本信息 中文名：芒果细菌性黑斑病菌。 学名: Xanthomonas campestris pv. mangiferaeindicae(Patel, Moniz & Kulkarni 1948)Robbs, Ribeiro &.Kimura 1974。 病害英文名：mango bacterial black spot。 属细菌界Bacteria，变形细菌门Proteobacteria，-变形细菌纲Gammaproteobacteria，黄单胞菌目 Xanthomonodales，黄单胞菌科Xanthomonodaceae，黄单胞菌属Xanthomonas。 病菌潜伏在病叶、病枝条、病果等组织内越冬，是主要的初侵染源。病菌借风雨、流水和接触传播， 远距离传播主要是带菌苗木、接穗和果实等。 芒果细菌性黑斑病菌的其他信息参见附录A。 4 方法原理 依据症状特征，以及该病菌的生物学特性、生理生化特性、分子生物学特性和致病性特征等进行检 测鉴定。 5仪器用具 生物显微镜、超净工作台、高压灭菌器、恒温培养箱、离心机（12000r/min）、分光光度计、PCR仪 电泳仪、凝胶成像仪、电子天平（感量0.0001g）、恒温水浴锅、恒温光照培养箱、低温冰箱、微量可调加 样器（10μL、100μL、200μL、1000μL)等。 6试剂和培养基 6.1试剂 MgCl2，dNTPs（dATP、dTTP、dCTP、dGTP），Taq酶，氧化酶试纸条，细菌微量生化鉴定管，引物 1 GB/T28094—2011 XgyrconpcrF1，Xgyrconrpcrl，Xgyrconfspl等购自生物公司。 除另有规定外，所有试剂均为分析纯，所有试验用水均为灭菌双蒸水。 6.2培养基 NA培养基，半选择性培养基NCTM3和KC见附录B。 7检疫鉴定方法及步骤 7.1现场检疫 芒果种植园的病害调查或进出境芒果样品的现场检疫中，若芒果植株或果实病害症状表现与附录 A中描述类似，取样带回实验室做进一步分离鉴定，取样方法和步骤参照SN/T2122。 7.2病原菌分离 选择较新鲜的发病组织，切取病健交界部位，用无菌水清洗三次。在培养血中滴入儿滴无菌水，将 病组织放无菌水中，并用灭菌玻棒研碎，10min后用接种环蘸取，在半选择性培养基NCTM3或KC 平板上划线分离，做不少于3个平板。置于28℃下，NCTM3培养基培养5d～6d，KC培养基培养 4d5d后观察。Xcm在这两种培养基上菌落特征相似，直径3mm～4mm，圆形，轻微凸起，边缘整 齐，白色或乳白色（少见黄色），黏液状。 基上进行分离纯化。 7.3分子生物学鉴定（PCR方法） 分子生物学检测中安全措施方面要求按照SN/T1193。 纯化后的菌株经28℃培养24h后，制备模板DNA，扩增gyrB基因，用无菌双蒸水代替模板做空 白对照，扩增目的片段大小约为700bp。PCR产物回收后测序，测序结果与GenBank数据库中的已知 模式菌株序列进行比对，该检测方法见附录B。 7.4生化指标测定 采用生化鉴定管对可疑菌株和芒果细菌性黑斑病菌标准菌株进行下列指标的检测，包括硝酸盐还 原，七叶灵水解，尿酶产生，HS产生，淀粉水解，明胶液化，阿拉伯糖、纤维二糖、半乳糖和果糖发酵，吲 哚产生，精氨酸双水解。 Xcm生化指标检测结果应为硝酸盐还原阴性，七叶灵水解阳性，H2S产生阳性，淀粉水解阳性，明 胶液化阳性，能从阿拉伯糖、纤维二糖，半乳糖和果糖产酸，吲哚产生阴性，尿酶阴性，精氨酸双水解 阴性。 7.5致病性测定 针刺接种苗木在温室或田间进行，离体叶片法接种在室内平皿保湿进行。取在NA培养基上培养 24h的菌株用无菌水配成约为10°CFU/mL的菌悬液接种。用无菌水作阴性对照，芒果细菌性黑斑病 菌标准菌株作阳性对照。接种后的苗木保持湿度90%；离体叶片置培养皿中，叶柄用浸有50×10-6 6-氨基嘌呤（6-BA)培养液的脱脂棉保湿。温度白天30℃，晚上26℃，光照12h。接种9d后观察是 否出现水渍状病斑。 SAG 2 GB/T 28094—2011 8 结果判定 分离纯化得到的细菌菌株同时符合以下三个方面的检测结果，则可以判定检出Xcm。 a）在半选择性培养基上的菌落特征与描述相符； b) 生理生化测定结果与描述相符； PCR扩增产物测序结果与已知Xcm的gyrB基因同源性在98%以上；或致病性测定表现典型 c) 症状。 9 样品保存 检出Xcm的样品至少保存6个月，以备复检、谈判和仲裁；保存期满后，需经灭菌后方可处理。 10 菌种保存 分离并最终鉴定为Xcm的菌株应转接到NA培养基试管斜面上，经登记和经手人签字后置于4℃ 低温冰箱中保存，30d～60d转接一次，以防止病菌死亡，以备复核、谈判和仲裁。必要时将菌株用真空 冷冻干燥机冻干后长期保存。 3