ICS 65.020.30 CCS B 43 DB15 内 蒙 古 自 治 区 地 方 标 准 DB15/T 2036—2020 奶牛细菌性乳房炎精准治疗药物 筛选技术规程 Drug screening regulation of precise treatment for bacterial mastitis in dairy cows 2020-11-30 发布 内蒙古自治区市场监督管理局 2020-12-30 实施 发 布 DB15/T 2036—2020 前 言 本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 本文件由内蒙古自治区农牧业科学院提出。 本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。 本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院。 本文件主要起草人：王丽芳、姚一萍、史培、杨健、宋洁、张三粉、钟华晨、郭晨阳、连海飞、羿 静、冯小慧、凤英、云伏雨。 I DB15/T 2036—2020 奶牛细菌性乳房炎精准治疗药物筛选技术规程 1 范围 本文件规定了奶牛细菌性乳房炎精准应用抗生素的技术措施。 本文件适用于奶牛养殖场采用精准治疗的药物筛选技术操作程序。 2 规范性引用文件 本文件没有规范性引用文件。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 乳房炎 mastitis 乳腺组织受到物理、化学、微生物刺激所发生的以乳腺组织发生病理变化，乳汁中的体细胞增多， 乳的性状品质发生异常为特征的一种炎性变化。 3.2 最小抑菌浓度 minimal inhibit concentration 用试管稀释法测定细菌对药物的敏感性。完全抑制细菌生长的最高稀释管1毫升所含的药量。亦即 被测细菌对该药的敏感度。因药物和细菌的种类不同，需具体规定药物的稀释范围使用培养基的种类、 加菌量，培养条件和判定结果的时间。 3.3 耐药性 drug resistance 细菌与药物多次接触后，对药物的敏感性下降甚至消失，致使药物对耐药菌的疗效降低或无效。 3.4 耐药率 drug resistance rate 耐药菌的数量占总菌数量的比例，常以百分率表示。 3.5 大肠杆菌 Escherichia coli 肠杆菌科、埃希氏菌属中的主要细菌。 1 DB15/T 2036—2020 注：兼性厌氧菌，在普通培养基上生长良好，最适生长温度为37 ℃， pH为7.2～7.4。 3.6 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 葡萄球菌属，革兰氏阳性菌。 注：最适生长温度为37 ℃，pH为7.0～7.5，耐高盐，在含10 %-15 % NaCl肉汤或营养琼脂培养基上能够生长。 3.7 无乳链球菌 Streptococcus agalactiae 一种革兰氏阳性链球菌，可以导致感染腺体，长期减少产乳量。 注：该菌生长适宜温度为37 ℃，pH为7.4～7.6，在普通培养基中生长不良，在加有血液或血清的培养基中生长良 好。 3.8 克雷伯氏菌 Klebsiella 克雷伯氏菌属，是一种无运动力，有荚膜的革兰氏阴性菌。 注：兼性厌氧菌，对营养要求一般，最适生长温度为37 ℃。 4 试剂和材料 4.1 乳头药浴液。 4.2 甘油（C3H8O3） 。 4.3 75 %酒精棉球。 4.4 无菌离心管 10 mL。 4.5 离心管 50 mL。 4.6 5 %绵羊血琼脂平板。 4.7 60 %无菌甘油：在 40 mL 蒸馏水中加入 60 mL 甘油(4.2)，配制后进行灭菌，置于 4 ℃保存。 4.8 9 cm 直径的培养皿。 4.9 1 uL 和 10 uL 两种规格的无菌接种环。 4.10 16 S rDNA 引物。 4.11 PCR 试剂盒。 4.12 DNA marker：DL 2000。 4.13 MHB 肉汤。 4.14 比浊管。 2 DB15/T 2036—2020 4.15 质控菌株 ATCC 29213/25922。 4.16 96 孔组合式药敏 MIC&MBC 测试盒（冻干型），产品信息详见说明书。 4.17 灭菌吸头(5 mL/1 mL/ 200 uL/10 uL)。 4.18 灭菌离心管 2 mL。 4.19 无菌医用棉签。 5 仪器和设备 5.1 电子天平：感量为 0.001 g。 5.2 高压灭菌锅。 5.3 生物安全柜。 5.4 恒温培养箱。 5.5 恒温振荡培养箱。 5.6 高速离心机：转速 12000 r/min。 5.7 PCR 仪。 5.8 微波炉。 5.9 DNA 电泳设备。 5.10 凝胶成像系统。 5.11 麦氏比浊仪。 5.12 移液器（包括多通道 300 uL，单通道 5 mL/1 mL/200 uL/10 uL/2.5 uL） 。 5.13 冰箱：-20 ℃。 5.14 冰箱：-80 ℃。 6 分析步骤 6.1 样品采集 采样前进行CMT（或LMT）检测，确定其是否为乳房炎患牛。采集乳房炎阳性样本，采时弃去前三把 奶，无菌取乳样50 mL左右，4 ℃保存待检。 6.2 细菌的分离、纯化和保存 6.2.1 分离 3 DB15/T 2036—2020 将奶样混匀，用无菌医用棉签蘸取奶样，划线接种到直径为9 cm的5 %绵羊血琼脂平板，将平板放 在 37 ℃的恒温培养箱中培养，剩余的奶样置于4 ℃冰箱中保存，备用。24 h～ 48 h后观察菌落生长 情况及形态特征，并做好记录。 6.2.2 纯化 用1 uL的无菌接种环挑取典型单个菌落, 接种到不同的肉汤中于 37 ℃恒温摇床培养箱中增菌培 养。16 h～24 h后用1 uL的无菌接种环在血平板上进行划线培养，将平板放在 37 ℃的恒温培养箱中培 养 24 h ～48 h。若无杂菌生长则认为该细菌已是纯化的细菌，若有杂菌生长则需重新纯化。 6.2.3 保存 从血平板上挑取已经纯化的典型单个细菌接种到肉汤中，于 37 ℃恒温振荡培养箱中增菌培养8 h～ 16 h，按照400 uL菌液加入200 uL 60 %无菌甘油的比例进行菌种保存，充分混匀，制成终浓度为 20 %的甘油菌，封口，做好标记-80 ℃冰箱冷冻保存。 6.3 病原菌鉴定 6.3.1 分子生物学鉴定 6.3.1.1 细菌基因组 DNA 的小量提取 用水煮法或细菌基因组 DNA 小量提取试剂盒进行提取（具体方法参照分子克隆指南或相关产品说 明书） 。 6.3.1.2 16S rDNA 基因的 PCR 扩增 以提取出的细菌基因组DNA为模板，根据GenBank上的DNA序列设计通用引物。其引物序列为： Bacterial 16s-F：ACGCGTCGACAGAGTTTGATCCTGGCT， Bacterial 16s-R：CGCGGATCCGCTACCTTGTTACGACTT。 反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，75 ℃延伸90 s，反应进行30个 循环；72 ℃延伸10 min。预期目的条带大小为1500 bp。 6.3.1.3 鉴定 送基因测序公司进行分析，所测基因序列与GenBank中已有序列进行Blast同源性比对，确定病原菌。 7 药敏试验 7.1 受试菌液制备 挑取已经鉴定的单个菌落接种到肉汤中（肠杆菌用MH肉汤，葡萄球菌用MH肉汤，链球菌用含5 %血 清的MH肉汤） ，置于37 ℃恒温摇床培养箱中培养。葡萄球菌培养8 h～ 12 h、链球菌培养20 h～ 24 h， 4 DB15/T 2036—2020 大肠杆菌培养8 h～ 12h。随后使用比浊仪检测菌液的浓度，最终制成0.5个麦氏浊度单位的细菌悬浊液 （约1×108 CFU/mL）。将0.5个麦氏浊度单位的细菌悬浊液稀释1000倍，此时细菌悬浊液（约1×105 CFU/mL） ，此后将100 uL的细菌悬浊液加入100 uL的稀释药物中（约5×104 CFU/mL）。制备好的细菌悬 浊液在30 min内接种并培养。 7.2 最小抑菌浓度（MIC）检测 移液器先吸取100 uL无菌肉汤加入到第12孔中，作为空白对照，然后吸取100 uL稀释好的菌液依次 加入到96孔反应板的第1～11孔中。在37 ℃恒温培养箱中培养16 h～ 20 h，进行MIC结果的读取。只加 细菌孔生长良好且只加MH肉汤孔无细菌生长时，可进行下一步。细菌对某种药物的MIC，即抑制细菌生 长的最低抑菌浓度，一般判定是参考细菌生长孔前一孔的浓度，即为MIC值（用甲氧苄啶和磺胺类药物 进行测试时，培养基中的拮抗剂容易导致微生物的少量生长。当相比对照孔某一孔的药物浓度能抑制不 小于80 %的微生物生长时即可判定该浓度为终点浓度）。 8 数据处理 先确定大肠杆菌ATCC25922标准菌株、金黄色葡萄球菌ATCC29213标准菌株的MIC数据是否符合质控 要求，在此基础上确认各菌株的MIC检测结果有效性。 9 药物敏感性判定 测试菌株药物敏感性判定参考CLSI或EUCAST标准，详见表1和表2。 表1 革兰氏阳性细菌耐药性判定标准 单位为μ g/mL 金黄色葡萄球菌 无乳链球菌 PEN(＞0.25) PEN(≥2) AMP(≥0.5) AMP(>2) AMC(≥8/4) AMC(≥8/4) OX(≥4) OX(无标准) CF(≥ 32) CF(≥32) EFT(≥ 8) EFT(≥ 8) CC(＞4) CC(≥ 1) ERY(≥ 8) ERY(≥ 1) GEN(≥16) GEN(≥16) DOX(≥16) DOX(≥1) FFC(≥ 8) FFC(＞8) RIF(≥4) RIF(≥4) 5 DB15/T 2036—2020 表1 革兰氏阳性细菌耐药性判定标准（续） 单位为μ g/mL 金黄色葡萄球菌 无乳链球菌 VA(≥ 16) VA(＞2) CIP(≥4) CIP（无标准) SIZ(≥512) SIZ(≥512) TMP/SMX(≥4/76) TMP/SMX(≥4/76) 注 1：药物缩写：PEN-青霉素；AMP-氨苄西林；AMC-阿莫西林+克拉维酸（2:1） ；OX-苯唑西林；CF-头孢噻吩（可 代表头孢氨苄） ；EFT-头孢噻呋；CC-克林霉素（可代表林可霉素） ；ERY-红霉素；GEN-庆大霉素；DOX-多西环素；FFC氟苯尼考；RIF-利福平(可代表利福昔明)；VA-万古霉素；CIP-环丙沙星；SIZ-磺胺异噁唑； TMP/SMX-甲氧苄啶+磺 胺甲噁唑(1:19)。 注 2：药物后括号内数值代表细菌对该药物耐药的判定标准。 表2 革兰氏阴性细菌耐药性判定标准 单位为μ g/m