ICS 65.020.30 CCS B 41 湖 DB42 北 省 地 方 标 准 DB 42/T 1592—2020 鸭坦布苏病毒双抗夹心 ELISA 抗原检测 规程 Technical procedures of the double antibody sandwich ELISA assays for detection of duck tembusu virus （报批稿） 2020 - 07 - 07 发布 湖北省市场监督管理局 2020 - 11 - 07 实施 发 布 DB42/T XXXX-XXXX 目  次 前言..................................................................................................................................................................... II 引言................................................................................................................................................................... III 1 范围................................................................................................................................................................. 1 2 规范性引用文件............................................................................................................................................. 1 3 术语和定义..................................................................................................................................................... 1 4 试剂和材料..................................................................................................................................................... 1 5 抗体包被板的制备......................................................................................................................................... 2 6 待检样品处理................................................................................................................................................. 2 7 检测步骤......................................................................................................................................................... 2 8 废弃物处理和防止污染的措施.....................................................................................................................2 附录 A（资料性） 鸭坦布苏病毒单克隆抗体的制备................................................................................... 4 附录 B（资料性） 对照品的制备....................................................................................................................8 附录 C（规范性） 试剂的配制...................................................................................................................... 10 I DB42/T XXXX-XXXX 前  言 本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起 草。 本文件由华中农业大学提出。 本文件由湖北省农业农村厅归口。 本文件起草单位：华中农业大学、武汉科前生物股份有限公司。 本文件主要起草人：金梅林、孙小云、陈伦勇、张雪、孙小美、但汉并、赵联忠、李冉、董晓辉、 徐高原。 本 文 件 实 施 应 用 中 的 疑 问 ， 可 咨 询 湖 北 省 农 业 农 村 厅 ， 联 系 电 话 ： 027-87665821 ， 邮 箱 ： hbsnab@126.com；华中农业大学，联系电话：027-87282038，邮箱：xys@mail.hzau.edu.cn。 对 本 文 件 的 有 关 修 改 意 见 建 议 请 反 馈 至 华 中 农 业 大 学 ， 电 话 ： 027-87286905 ， 邮 箱 ： jml8328@126.com。 II DB42/T XXXX-XXXX 引  言 鸭坦布苏病毒病（Duck Tembusu Virus Disease）是主要引起蛋鸭产蛋量急剧下降的一种疾病，严 重的则会出现绝产。该病传播极为迅速，短时间内波及全群，发病率高达100%，死亡淘汰率则根据不同 的品种在2%-55%之间。在 2011年召开的第一届水禽疫病防控研讨会期间，中国畜牧兽医学会将该传染 病正式统一命名，称为“鸭坦布苏病毒病”。 鸭坦布苏病毒病的疾病传播特点和危害使得病原的监测和检测成为各地疫控部门和各个规模化养 殖场的重要工作之一。 III DB42/T XXXX-XXXX 鸭坦布苏病毒双抗夹心 ELISA 抗原检测规程 1 范围 本文件规定了鸭坦布苏病毒双抗夹心ELISA抗原检测的术语和定义、试剂和材料、抗体包被板的制 备、待检样品处理、检测步骤、废弃物处理和防止污染的措施。 本文件适用于鸭坦布苏病毒病原的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件， 仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。 GB/T 6682-2008 分析实验室用水规格和试验方法。 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 鸭坦布苏病毒 Tembusu virus 鸭坦布苏病毒是一种急性传染病，以蛋鸭、种鸭产蛋骤然下降为主要临床特征、以出血性卵巢炎为 主要病变特征。 3.2 酶联免疫吸附法 Enzyme-linked immune sorbent assay 酶联免疫吸附法是将抗原抗体反应的高度特异性与酶标记技术相结合，将已知的抗原或抗体标记上 酶示踪物质，利用酶对底物的高效催化作用，通过酶标仪测定酶分解底物产生的有色物质的光密度值， 计算抗原或抗体的含量。 3.3 630nm 吸光度值 Optical density at 630nm OD 值表示被检测物吸收掉的光密度，是检测方法里的专有名词，检测单位用 OD 值表示， OD=lg(1/trans)，其中 trans 为检测物的透光值,因此又叫通光率。630nm 吸光度值即为在 630nm 的波长 下测 OD 值。 4 试剂和材料 4.1 试剂 鸭坦布苏病毒单克隆抗体、辣根过氧化物酶标记鸭坦布苏病毒单克隆抗体、TMB 底物显色液、终 止液、阳性对照品、阴性对照品、样品稀释液、20 倍浓缩洗涤液、碳酸盐包被液、封闭液。 鸭坦布苏病毒单克隆抗体制备、纯化及HRP标记鸭坦布苏病毒单克隆抗体制备方法见附录A。 1 DB42/T XXXX-XXXX 阳性对照品、阴性对照品的制备方法见附录B。 试剂配方见附录C。 4.2 仪器设备及耗材 离心机（12000rpm）、恒温箱（37℃）、聚苯乙烯微量反应板（96 孔）、酶标仪（630nm 波长）、多 道移液器（300μL） 、单道移液器（100μL、1mL）。 5 抗体包被板的制备 5.1 鸭坦布苏病毒单克隆抗体的包被 将纯化的鸭坦布苏病毒单克隆抗体用碳酸盐包被液稀释至5.98ng/μL，每孔加100μL，置于2℃～8℃ 冰箱静置12h～15h。 5.2 包被板的封闭 弃净包被板中所有的液体，每孔加入封闭液200μL，置于37℃恒温箱静置2h；再次弃净包被板中所 有的液体，将包被板静置于37℃恒温箱2h。 6 待检样品处理 6.1 拭子样品的处理 在装有拭子的离心管中，加入500μL样品稀释液，充分振荡涡旋后，10000rpm离心3min，弃沉淀， 取100μL上清进行检测。 6.2 组织样品的处理 每份组织样品取1g，加入2mL样品稀释液，研磨匀浆，12000rpm离心2min，取上清，再次12000rpm 离心3min，取100μL上清进行检测。 7 检测步骤 7.1 取制备好的抗体包被板，用洗涤液洗涤 3 次，弃净孔中液体，将处理好的待检样品、阴性对照和 阳性对照各取 100μL 加至抗体包被板中，阴、阳性对照各设 2 孔，置 37℃恒温箱中下温育 60min。 7.2 弃去孔中液体，每孔加入洗涤液 300μL/孔，重复洗涤 5 次。 7.3 将辣根过氧化物酶标记的鸭坦布苏病毒单克隆