ICS 65.020.30 B 43 DB45 广 西 壮 族 自 治 区 地 方 标 准 DB 45/T 1951—2019 水牛胚胎冷冻保存技术操作规程 Manipulation regulation for cryopreservation of embryos in buffalo 2019 - 05 - 31 发布 广西壮族自治区市场监督管理局 2019 - 06 - 30 实施 发 布 — DB45/T 1951 2019 目 次 前言 ................................................................................ II 1 范围 .............................................................................. 1 2 规范性引用文件 .................................................................... 1 3 术语和定义 ........................................................................ 1 4 试剂、耗材、设备和实验室要求 ...................................................... 2 5 冷冻胚胎的选择和标记 .............................................................. 2 6 冷冻载体的准备 .................................................................... 3 7 胚胎的冷冻 ........................................................................ 3 8 贮存与运输 ........................................................................ 4 9 胚胎的解冻 ........................................................................ 4 附录 A（规范性附录） 试剂、耗材和设备 ................................................ 6 附录 B（规范性附录） 胚胎冷冻和解冻液体 .............................................. 8 附录 C（规范性附录） 胚胎冷冻和解冻记录表 ............................................ 9 I — DB45/T 1951 2019 前 言 本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。 本标准由广西壮族自治区农业农村厅提出。 本标准由广西畜牧业标准化技术委员会归口。 本标准起草单位：广西壮族自治区水牛研究所。 本标准主要起草人：杨春艳、尚江华、郑海英、黄加祥、覃广胜、黄芬香、于农淇、梁贤威。 II — DB45/T 1951 2019 水牛胚胎冷冻保存技术操作规程 1 范围 本标准规定了水牛胚胎超低温冷冻技术规程，包括程序化冷冻和玻璃化冷冻技术要求。 本标准适用于体内胚胎和通过体外受精、单精子胞质内显微受精、体细胞核移植技术生产的胚胎。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 5458 液氮生物容器 GB/T 25881 牛胚胎 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 超低温保存 cryopreservation 将经冷冻保护剂处理的胚胎放置在－196 ℃（液氮）的超低温度中，使其新陈代谢暂时停止，从而 进行长期保存。 3.2 体内胚胎 in vivo embryos 通过激素促进母畜超数排卵，再采用自然交配或人工授精，从母畜的输卵管或子宫角内回收发育到 一定时期的早期胚胎。 3.3 水牛胚胎体外生产技术 in vitro production,IVP 模拟水牛体内环境，在体外人工控制条件下，通过采集水牛卵巢上未成熟的卵母细胞经体外成熟培 养、精子体外获能、精卵体外受精和受精卵胚胎体外培养等技术生产胚胎。 3.4 体外受精 in vitro fertilization,IVF 模拟体内环境使哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术。 1 — DB45/T 1951 2019 3.5 胞浆内单精子注射技术 intracytoplasmic sperm injection,ICSI 借助显微操作系统将单一精子注射入卵子内使其受精的技术。 3.6 体细胞核移植 somatic cell nuclear transfer,SCNT 将一个动物的体细胞核移入去核的成熟卵母细胞中，产生与供体动物遗传成份基本一致的动物后代 技术。 4 试剂、耗材、设备和实验室要求 4.1 试剂 所用试剂、药品以及要求见附录A.1。 4.2 耗材 所用耗材见附录A.2。 4.3 设备 所用主要设备见附录A.3。 4.4 实验室要求 工作区应设置准备室、缓冲间、无菌间、细胞保存室等。其中，缓冲间面积不得小于3 m ，应安置 更衣柜和紫外灯，紫外灯强度不得低于1.5 W/m 。紫外灯管距地面不应超过2.5 m，每次照射时间为20 min～30 min。无菌室的无菌等级最低标准应达到万级，操作区应达到百级。 2 3 5 冷冻胚胎的选择和标记 5.1 各胚胎发育阶段和质量等级的标记 胚胎发育阶段划分和胚胎分级评定应符合 GB/T 25881 的规定。水牛胚胎的发育时间相较于牛应 提前 12 h。胚胎冷冻前的质量应达到 B 级（含 B 级）以上。 5.1.2 桑椹胚（ML）、致密桑椹胚（CM）、早期囊胚（EB）、囊胚（BL）、扩张囊胚（EXB）、孵化囊 胚(HB)的缩写应统一规范。 5.1.1 5.2 不同种类胚胎的标记 体内胚胎标记为IVE，体外受精胚标记为IVF，胞质内单精子显微注射胚胎标记为ICSI，体细胞核移 植胚胎标记为SCNT。 5.3 胚胎细管标记 细管上标记的胚胎信息含冷冻时间、胚胎种类、胚胎个数、发育阶段、质量。具体标记见如下 示例：如 2017 年 7 月 20 日冷冻 2 枚 A 级 IVF 扩张囊胚，其登记的序号为 101，则标记为 170720 IVF 2EXB 5.3.1 2 — DB45/T 1951 2019 如果 当天 两枚 级 S N EX 同 做好详尽 格 扩张 供 号为 信息登 见 为 A 101。而 是 冷冻 A 体细胞核移植 胚胎，其细胞 体牛的序 4001，则标记 170720 C T 2 B A 4001。 5.3.2 时 的胚胎冷冻表 ，注 胚胎所有的 ，胚胎 记表 附录 C。 明 相关信息 6 冷冻载体的准备 6.1 程序化细管的准备 料 无毒、耐低温，细管规格以0.25 mL为宜，细管外观正常、无变形、无裂痕， 程序化冷冻细管材 应 封口严密。 6.2 玻璃化冷冻载体的准备 以采用商业化的玻璃化冷冻载体；也可以采用0.25 mL细管，用刀片将其一端斜切，形成一截斜 切面 以此切面作为玻璃化冷冻的载体，如图1所示。 可 ， 图1 玻璃化冷冻载体 7 胚胎的冷冻 7.1 胚胎的程序化冷冻 7.1.1 胚胎的洗涤 级 级 洗涤2～3次。 将A 、B 胚胎置于胚胎培养液中 7.1.2 胚胎的平衡 分见附录B。将洗涤后的胚胎放入冷冻液中，室温下平衡15 min～20 min。 程序化胚胎冷冻液成 7.1.3 胚胎的装管 装 顺 为 cm～ cm）→气泡（0.2 cm～0.5 cm） 平衡后 装入 mL cm～ cm →气泡 cm～ cm → cm～3 cm），再用封口粉沾水封 → 每支 装 ～ 枚 状况 供 相同 如图 示 3 将 的胚胎 0.25 细管中， 管 序 ：冷冻液（2 7 ） （0.2 0.5 ） 冷冻液（2 冷冻液加胚胎（6 口。 细管可 1 2 发育 与 体 的胚胎， 2所 。 图2 胚胎的装管顺序 3 — DB45/T 1951 2019 7.1.4 冷冻程序 将装好胚胎的冷冻细管装入加好液氮的程序化降温仪内，棉塞一头朝上或者朝外，以4 ℃/min的速 率降至-7 ℃，用镊子缠好灭菌棉，浸入液氮，迅速接触细管棉塞和冷冻液的交界面进行植冰。植冰后 在-7 ℃平衡5 min，以0.3 ℃/min的降温速率降至-36 ℃后，直接将细管投入液氮内。 7.2 胚胎的玻璃化冷冻 7.2.1 液氮的准备 取一保温壶，将液氮加至约三分之二处，盖好后备用。 7.2.2 冷冻平衡液和冷冻液的准备 取一塑料平皿，分别加入3滴各100 µL的冷冻平衡液和3滴各100 µL的冷冻液，室温下平衡5 min～ 10 min。 7.2.3 冷冻胚胎的平衡 胚胎在胚胎培养液内清洗2～3次后，转至平衡液滴内清洗2次，再将清洗后的胚胎转入第三滴平衡 液内在室温下保持5 min。 7.2.4 玻璃化冷冻步骤 平衡后的胚胎用胚胎冷冻液清洗两次后，吸取胚胎和少量的冷冻液（不宜超过1 µL），在体视显微 镜下放置在冷冻载体的截面上，如果冷冻液过多可吸除部分冷冻液。再将带有胚胎的一端浸入液氮，保 持3 s，再将整个载体浸没入液氮。 8 贮存与运输 贮存冻胚和液氮的生物容器均不可叠放。用液氮生物容器贮存时，细管应完全浸没到液氮中。液 氮容器应符合 GB/T 5458 的规定。 8.2 移动液氮生物容器时，应轻拿轻放，防止冲撞、震动和倾倒。 8.3 运输时，应有专人负责，途中应及时检查和补充液氮。运输过程中注意防挤压、防冻、防雨淋、 防晒、通风散热。 8.1 9 胚胎的解冻 9.1 程序化冷冻胚胎的解冻 9.1.1 解冻液的准备 解冻液为常规的胚胎培养液，在胚胎解冻前2 h将胚胎培养液作一100 µL微滴，并覆盖石蜡油，放 入培养箱平衡备用。 9.1.2 细管的解冻 将胚胎细管空气浴10 s后置于35 ℃～37 ℃水浴中，浸浴30 s至胚胎冷冻细管彻底溶化。用消毒卫生 纸擦干细管，剪去封口端，将胚胎推入培养皿中；在