中华人民共和国城镇建设行业标准 生活垃圾渗沥水 细菌总数的检测 平板菌落计数法 Leachate-Detecton of total bacterial number--plate count for bacterial colonies CJ/T3 3018.14—93 1主题内容与适用范围 本标准规定了用平板菌落计数法测定渗沥水的细菌总数。 本标准适用于从生活垃圾中渗出来的液体。 2引用标准 GB5750生活饮用水标准检验法细菌总数 GB4789.2食品卫生微生物学检验菌数总数测定 3术语 细菌总数是指1mL渗沥水试样在一定条件下塔养后所生长的细菌菌落的总数。 4原理 每种细菌都有其一定的生理特性，应用不同的营养物质及其它生理条件（如温度、培 养时间、pH、需氧性质等）去满足它，才能分别地将各种细菌培养出来。在实际工作中， 一般都只用一种方法（即在营养琼脂培养基中，于37℃经24h培养）进行细菌总数的测定， 因此，所得结果只包括一群能在营养琼脂上发育的嗜中温性需氧及兼性厌氧的细菌菌落总 数。 5培养基和试剂 本标准所用试剂，除另有说明外，均为符合国家标准或行业标准的化学纯试剂和生化 试剂，均为蒸馏水或去离子水。 5.1无水乙醇（CHsOH）。 5.2氢氧化钠（NaOH），15%（m/m）溶液 中华人民共和国建设部1993-05-03批准 1993-09-01实施 50 CJ/T3 3018.14—93 将15g氢氧化钠（NaOH)，溶于100mL水中。 5.3营养琼脂 5.3.1成份：蛋白陈 10g 牛肉膏 3g 氟化钠 5g 琼脂 10~20g 蒸馏水 1000mL 5.3.2制法 将上述成份混合后，加热溶解，滴加氢氧化钠溶液（5.2）调整pH为7.4~7.6，用漏 斗分装约15mL干玻璃试管（6.8），在121℃高压灭菌20min。冷却后贮存在冷暗燥处备 用。 5.4生理盐火 将8.50～9.50g氟化钠（NaC1）溶于水中，稀释成1000mL，摇勾。pH值应为4.5~ 7.0。 6仪器、设备 6.1高压蒸汽灭菌器。 6.2于燥箱：最高工作温度300℃。 6.3恒温培养箱：36±1℃。 6.4冰箱。 6.5恒温水浴：46±1℃。 6.6放大镜。 6.7稀释瓶：125mL小口玻璃方瓶。 6.83 玻璃试管：18×180mm，平口。 6.9 平皿：直径90mm。 6.10 刻度吸管：1mL，10mL，分度至0.1mL。 6.11 酒精灯。 7样品 供细菌总数检测的渗沥水实验室样品量约需100mL，用经灭菌处理过的玻璃瓶采集。 采样后应尽快检测，在2h内不能处理时，应置于温度为2～5℃处，最长保存时间为6h。 8步骤 8.1准备工作 8.1.1工作室及操作台经清扫后，用紫外线灭菌10min。 8.1.2玻璃器血置于干燥箱中于160℃灭菌2h。 8.1.3将装有90mL生理盐水的稀释瓶和9mL生理盐水的试管，前者瓶口橡皮塞衬.上滤纸 51 CJ/T3018.1493 条，后者管口塞上棉花球，置高压蒸汽灭菌器（6.1)内，于121℃灭菌20min，冷却待用。 8.1.4将营养琼脂培养基（5.3.2）置于沸水锅内，融化后随即转入46土1℃恒温水浴，保 温待用。 S.2试样稀释 8.2.1以无菌操作，吸取经充分混勾的试样10mL于盛有90mL灭菌生理盐水的稀释瓶 （8.1.3）中，充分混匀后就成1：10的稀释液。 8.2.2吸取1：10稀释液1mL，沿管壁徐徐注入盛有9mL灭菌生理盐水的试管（8.1.3)中， 混匀而成1：100的稀释液。 8.2.3按上述操作进行10倍递增稀释，每递增稀释1次，随即换用1支1mL灭菌刻度吸 管。 8.3倾注平Ⅲ 8.3.1根据试样污染程度大小，选择合适的三个连续释度试样进行倾注平Ⅲ。在分别作 10倍递增稀释的同时，随即用该稀释度的吸管移取1mL稀释液于灭菌平皿内，每个稀释度的 试样液用2个平血。 8.3.2将保温在46℃水浴锅内的营养琼脂培养基倾注于平血内，并立即转动或倾斜平Ⅲ， 使稀释液与培养基充分混合。 同时，将营养琼脂培养基倾入加有1mL空白灭菌生理盐水的另外2个灭菌平皿作空 白对照。 8.4平板培养 待琼脂凝固后，翻转平板，使底面向上，置于36土1℃恒温塔养箱内培养242h。 8.5菌落计数 8.5.1培养后，应立即计数每个平板上的菌落数。如果遇上不能立即计数，应将平皿存 放于5～10℃，但不得超过24h。 8.5.2作平板菌落计数时，用肉眼观察计数，必要时用放大镜检查，以防遗漏。按30～ 300个菌落计数规则计算平板的菌落数。 8.6菌落计数规则 8.6.1首先选择平均菌落数在30～300之间的稀释度，乘以稀释倍数报告之（见表1中例 1)。 8.6.2若有2个稀释度，其平均菌落数均在30～300之间，则视两者之比来决定。若其比 值小于2，应报告其平均数；若大于2，则报告其中较小的菌落总数（见表1中例2或例 3 )。 8.6.3若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释 倍数报告之（见表1中例4）。 8.6.4若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释 倍数报告之（见表1中例5）。 8.6.5若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之间，其中～部分大于300或小于30时， 则以最接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中例6）。 52