ICS 07.080 A21 中华人民共和国国家标准 GB/T38568—2020 工业微生物菌株生长表型测定 微液滴浊度法 Determination of growth phenotype for industrialmicrobial strain- Microdroplet turbidity 2020-03-31实施 2020-03-31发布 国家市场监督管理总局 发布 国家标准化管理委员会 GB/T38568—2020 前言 本标准按照GB/T1.12009给出的规则起草。 本标准由中国标准化研究院提出并归口。 本标准主要起草人：马波、葛安乐、王喜先、籍月彤、徐健、马爱进。 GB/T38568—2020 工业微生物菌株生长表型测定 微液滴浊度法 1范围 本标准规定了用微液滴浊度法测定工业微生物菌株生长表型的方法。 本标准适用于工业发酵用细菌、真菌和微藻菌株生长表型测定。 2规范性引用文件 2 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件 GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法 GB/T14926.43实验动物细菌学检测染色法、培养基和试剂 3术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 参考菌株referencestrain 发酵性能明确，用于发酵生产的经过鉴定的保存菌株。 4原理 通过微流控芯片产生单细胞包裹液滴，并培养，根据液滴中的菌体面积，进行生长速率的计算。 5 试剂或材料 除非另有规定，所用试剂均为分析纯。 5.1水 符合GB/T6682规定的二级水。 5.2基础培养基 按GB/T14926.43给出的方法配制。或选用商品化的预制培养基，严格按照商品说明书加水 配制。 5.3 3PBS缓冲液·pH7.4 称取磷酸二氢钾（KH,PO）0.27g、磷酸氢二钠（NazHPO,）1.42g、氯化钠（NaCI)8g、氯化钾 (KCI)0.2g，将上述各成分加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加人浓盐酸调pH至7.4，最后定 1 GB/T38568—2020 容到 1 L 5.4超低融点琼脂糖 凝胶点为8℃~17℃。 5.5 5氟碳油。 含有表面活性剂。 6仪器设备 6.1恒温箱：士1℃。 6.2离心机:500g~4000g。 6.3倒置显微镜：带成像模块。 6.4聚四氟乙烯导管：内径0.5mm。 6.5PDMS微流控芯片：高度为100μm，后面连接有至少50个培养腔室结构，每个腔室尺寸为1.5mm X1mm。油相两侧线性结构相同，每一侧长为29.2mm，宽度为40um；水相的线性结构长为 4.54mm，宽度为60μm。 6.6分光光度计。 SZC 6.7热板。 7测定步骤 7.1菌株活化 别蘸取参考菌株和待评价菌株保种菌液，在固体平板上划线，根据生产工艺参数选择相应的温度和 液体培养基的试管中，根据生产工艺参数选择相应的温度和转速，培养至对数期。 选择相应的温度和转速，培养至稳定期，去除上清后加人PBS溶液，重复清洗3次。 7.2 微生物菌液浓度选取 用基础培养基稀释得到细胞悬液浓度约为6×105CFU/mL。 7.3琼脂糖溶液制备 用分析天平称取0.02g超低熔点琼脂糖置于无菌EP管中，并向其中加入1mL已灭菌的基础培养 基，加热溶解，配制成2%（质量浓度）的溶液。趁热用0.22μm的无菌滤头过滤，现用现配 7.4单细胞液滴发生 7.4.1各取500μL微生物菌液和琼脂糖溶液等体积混勾。 7.4.2取一块芯片，分别在芯片的油相人口加人200μL氟碳油和水相人口加人100μL低熔点琼脂糖 菌液，将注射器与芯片出口相连 7.4.3将芯片放在热板上（温度稳定性土1℃，范围在30℃37℃），将注射器的活塞固定在2mL刻 2